一株拮抗葡萄灰霉病的嗜線蟲致病桿菌發酵條件優化

曹林青，詹發強，楊 蓉，侯新強，包慧芳，侯 敏，王 寧，龍宣杞

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046；2.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國最大的葡萄產區，2016年產量達267.6×104t左右，位居全國第一[1]。葡萄灰霉病(gray mold)是由灰葡萄孢(Botrytiscrnerea)引起的一種比較常見且危害嚴重的病害，由于葡萄采后的貯藏環境利于灰霉菌的生長，每年造成葡萄采后的腐爛損失率達30%以上[2]。國內外葡萄保鮮技術主要是低溫結合二氧化硫(Sulfur Dioxide，SO2)防腐貯藏[3,4]。SO2的有效殺菌劑量和使葡萄受傷害的劑量相近，所以使用劑量不好控制，當SO2劑量過高時，葡萄抗氧化的酶促防御系統會受到損害，果實被漂白并產生異味[5]。嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdussp.)是小卷蛾斯氏線蟲(Steinernemacarpocapsae)的共生細菌，生存于侵染期線蟲前腸的菌囊內。該菌隨線蟲的侵染進入寄主血腔，迅速大量增殖并產生多種代謝產物，為寄主線蟲的生存提供合適的小生境。嗜線蟲致病桿菌的這一生理代謝特性已引起重視，并已從代謝物中發現了幾種新結構的抗生素[6]對細菌、酵母菌和真菌的生長具有廣泛抑制活性[7, 8 ]。研究葡萄的采后貯藏保鮮技術，對提高鮮食型葡萄的貯藏保鮮有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】培養的溫度和曝氣影響細菌的生長，影響抗生素的產生[9, 10]。Xenorhabdusspp為兼性厭氧菌，Chirayu Sa-uth等[11]通過響應面法優化了XenorhabdusstockiaePB09抗真菌活性的最佳培養基組成(蔗糖、酵母提取物、氯化鈉和磷酸氫二鉀等)。邱德文等[12]對致病桿菌D43菌株發酵培養基和發酵條件進行了研究，同時對該菌代謝過程pH值、還原糖、總糖、氨基氮與抗生素產量的關系進行了分析。接菌量較低時，菌體生長的遲滯期過長，致使培養發酵耗時較長。但接入過多體積的菌體時，可能會帶進過多的代謝產物，產生的代謝產物反饋抑制，從而影響抑菌物質的產生[13]。在液體發酵培養的過程中，裝液量和轉速影響著菌株對氧氣的需求程度[14]。【本研究切入點】現有葡萄灰霉病生防菌Xenorhabdusnematophila-ALL對其抑菌率相對不高且效價不穩定。需通過發酵條件優化以期提高其抑菌能力和水平?！緮M解決的關鍵問題】對嗜線蟲致病桿菌的液體發酵進行單因素和響應面法發酵優化，研究不同的培養基和不同的培養條件對灰葡萄孢的抑制作用，為開發和應用共生細菌Xenorhabdusnematophila-ALL生物防治葡萄灰霉菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試真菌

灰葡萄孢(Botrytiscinerea，簡稱B.cinerea)。

1.1.2 供試共生細菌

嗜線蟲致病桿菌(ALL)保存于新疆農業科學院微生物應用研究所農用微生物實驗室。

1.1.3 供試培養基

NBTA:營養瓊脂45 g，溴百里酚蘭 0.025 g，氯化三苯基四氮唑 0.04 g，蒸餾水1 L ；

NA培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L；

PDA培養基：馬鈴薯浸粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂14.0 g，蒸餾水1 L。1×105Pa滅菌20 min；

TSY培養基：酵母膏5 g，TSB 40 g，蒸餾水1 L，pH7.2～7.4；

TSB培養基：大豆胨5 g，胰蛋白胨15 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH7.2～7.4；

LB培養基：胰蛋白胨 0 g，酵母膏 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 L，pH7.2～7.4 ;

NB培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH7.2～7.4；

1.1.4 儀器與設備

MSSPX-250型生化培養箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺，Eppendorf5418R離心機，OLYMPUS CX41相差顯微鏡，OLYMPUS SZ61體式顯微鏡，ZWY-2102C恒溫培養振蕩器。

1.2 方 法

1.2.1 共生菌分離

無菌操作臺中，將由昆蟲病原線蟲致死的大蠟螟幼蟲放入75%的乙醇中，浸沒10 s左右，無菌濾紙吸去多余的酒精，剪開腹足，接種針沾取或擠出流出的液體至NBTA平板培養基上，28℃條件下暗培養36～48 h，直至出現能夠吸附藍色且周圍有透明圈即為目標菌[15]。

1.2.2 無菌上清液制備

將培養好的藍色Ⅰ型菌接種于NB培養基中，培養14 h得到種子液，以1%的比例接種于NB培養基中繼續培養36 h，在4℃，10 000 r/min，離心10 min，將離心得到的上清液經0.22 μm濾膜過濾。

1.2.3 菌絲生長抑制率

將離心過濾處理過的無菌上清液，與已滅菌冷卻至42℃的NA培養基以1∶100的比例混合均勻后倒入一次性培養皿中，每個處理4個重復。當對照組菌絲生長至培養皿邊緣時測定各個處理的抑制率。

抑制率=(對照組菌塊直徑-試驗組菌塊直徑)/(對照組菌塊直徑-菌餅直徑)× 100%。

1.2.4 單因素試驗

不同的培養基(NB、LB、TSB、TSY)，不同的培養時間(24、48、72、96、120、144 h)，種子液培養時間(12、16、20、24、28 h)，接種量(1%，3%，5%，7%，9%)，pH值(5，6，7，8，9)，轉速(160、180、200 r/min)，裝液量(10、20、30、40、50 mL/100mL)等因素對葡萄灰霉菌有顯著抑制效果的因素為后續的響應面試驗。

1.2.5 響應面優化設計

選取對試驗影響較為顯著的3個因素，利用Box-Behnken中心組合設計，進行三因素三水平響應面分析。

1.3 數據處理

采用Excel 2010計算數據，利用SPSS 22.0進行數據統計分析，使用Duncan多重比較檢驗法進行顯著性分析。采用軟件Design-Expert V8.0.5進行響應面的數據分析與處理。

2 結果與分析

2.1 單因素培養條件對ALL菌株發酵上清液抑菌活性的影響

2.1.1 培養基對發酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，不同的培養基對共生細菌的影響較大，差異性顯著(P<0.05)。TSY培養基對灰葡萄孢(B.cinerea)的菌絲抑制率最高，達48.12%。其次為TSB培養基，其抑制率為27.28%。LB培養基的抑制率最低，僅18.19%。TSB培養基與NB培養基的抑菌活性基本一致。因此將篩選出的TSY培養基作為后續對目標菌株ALL發酵條件優化的初始培養基。圖1

圖1 不同培養基發酵上清液下灰葡萄孢(B. cinerea)的抑制率變化

2.1.2 培養時間對發酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，培養不同的時間對ALL菌株發酵上清液的抑菌活性差異性顯著，24～120 h呈現出先上升后下降的趨勢，且在72 h表現出最強的抑菌活性。24 h時的抑菌活性最低，呈現這種趨勢的原因可能是在培養初期，搖瓶內菌體濃度暫時未達到最高值，隨著時間的延長，菌體濃度升高，次生代謝產物量大幅積累，抑菌活性顯著提高；隨著培養基內有限的營養和空間被用完，現抑制率降低。圖2

圖2 不同時間發酵上清液下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.1.3 種子液對發酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，培養不同時間的種子對B.cinerea菌絲的抑制率不同，在12～28 h內，種子液的抑制率持續上升并在28 h抑制率達到最高，在12 h抑制率為0，16～24 h的種子液幾乎無明顯的抑制率，且在28 h的種子液抑制率顯著高于其他時間的抑制率(P<0.05)。圖3

圖3 不同種子上清液下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.1.4 接菌量對發酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，不同比例接菌量對灰葡萄孢(B.cinerea)菌絲生長無明顯的顯著差異性(P>0.05)，5%的接菌量時，菌絲抑制率較高。圖4

圖4 不同接菌量下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.1.5 通氣量對發酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，各不同的裝液量對灰葡萄孢(B.cinerea)菌絲生長的抑制率有顯著性差異(P<0.05)。當裝液量為50%時，對菌絲抑制率最高，達到51.8%，顯著高于其他不同體積的裝液量。圖5

圖5 裝液量對灰葡萄孢(B.cinerea)抑制率變化

研究表明，轉速在180 r/min時，對菌絲生長抑制率最高且顯著高于其它兩個轉速的抑制率，達42.76%。圖6

圖6 不同轉速下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.1.6 pH對發酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，不同初始pH值對B.cinerea菌絲生長的抑制率不同，在初始pH為7時抑制率最高。起始 pH 直接影響共生細菌的生長環境，pH過高、過低都不利于菌體的生長。圖7

圖7 不同初始pH值下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.2 響應面因素優化分析

研究表明，擬合二次回歸方程如下：

Y=+82.65+1.86A+4.59B+7.56C+0.052AB+2.47AC+0.28BC-21.41A2-5.84B2-6.74C2

Y是因變量(抑制率)

R2=0.981 2R2adj=0.957 0

F=40.53，P<0.01，差異極顯著，模型建立有意義；R2=0.981 2，回歸方程擬合度良好，失擬項F=4.06，P>0.05，無顯著性差異，非正常誤差較小，得到灰霉菌的最佳抑制率。培養基初始pH值(A)、培養時間(B)、裝液量(C)對灰霉菌抑制率的主次影響順序:C>B>A。一次項B.C和二次項A2、B2、C2對響應值影響極顯著，其余項對響應值影響不顯著。表1～3

表1 因素水平編碼

表2 Box-Behnken試驗設計

表3 回歸模型方差

2.3 發酵時間與初始pH值對灰葡萄孢抑菌活性的影響

研究表明，當發酵時間恒定時，初始pH值在5～7時，抑制率呈現先增加后減少的趨勢。同樣地，當初始pH值一定時，隨著發酵時間在60～84 h時，抑制率呈現先增加后減少的趨勢。裝液量水平為0時，發酵時間與pH交互作用的等高線侵向于圓形，二者交互作用無顯著性。

當裝液量恒定時，初始pH值在5～7時，抑制率呈現先增加后減少的趨勢。當初始pH值一定時，裝液量在40～60 mL/100 mL時，抑制率呈現先增加后減少的趨勢。發酵時間水平為0時，裝液量與pH交互作用的等高線更接近于圓形，裝液量與初始pH值的交互作用不顯著。

當裝液量不變時，發酵時間在60 h與84 h之間時，抑制率呈現先增加后減少的趨勢。當發酵時間一定時，在裝液量在40與60 mL/100 mL時，抑制率呈現先增加后減少的趨勢。初始pH值水平為0時，裝液量與發酵時間交互作用的等高線非橢圓形，二者交互作用不顯著。圖8

3 討 論

在單因素優化試驗中，Xenorhabdusnematophila-ALL在TSY培養基中發酵培養48 h后其抑制率最高，其次為TSB培養基，與馬麗麗等[14]研究結果一致。要篩選出一種培養基作為發酵優化的初始培養基以期得到更多抑菌活性物質產量，4種培養基的配料成分分析，判斷大豆胨，胰蛋白胨是產生抑菌物質的關鍵成分。通過對發酵時間的優化，拮抗菌對灰葡萄孢的抑制率呈現先上升后下降又上升的趨勢，并在72 h時顯示出最高的抑制率，產生這種現象的原因可能是與細菌利用營養物質有關，影響其抑菌物質的產生。接菌量會影響Xenorhabdusnematophila-ALL生長速度，搖瓶內細菌起始量越多的可能會較早達到最大值，能早合成細菌的代謝產物，但在研究中，不同的接菌量無顯著差異。溶氧量影響發酵產物的產生，在液體搖床發酵培養過程中，裝液量和轉速影響著溶氧量，故兩者需結合起來分析[16-19]。研究顯示，當容積為50%時，轉速為180 r/min時抑菌活性最高，表明了此條件為拮抗菌發酵的最佳通氣量。pH作為共生細菌生長的重要環境因子，對其生長代謝及抑菌活性物質的產生有較大影響[20]。pH能影響細胞原生質的電荷，引起各種酶活性的變化，影響細菌底物的利用率和細胞結構，最終影響細胞的生長和產物的形成[21, 22]。研究發現，在培養基初始pH值為7.0時，抑制率最高，這與郭薔薇等[23]在相同pH值條件下通過嗜線蟲致病桿菌胞外產物對番茄灰霉病的結果一致。研究發現在中性環境中，Xenorhabdusnematophila發酵液能產生一些多肽，水溶性蛋白類抑菌物質，而在酸性和堿性環境中不利于該物質的產生。研究經過響應面分析結果發現目標菌株發酵上清液初始pH值，發酵時間，裝液量等3個因素對灰葡萄孢(B.cinerea)菌絲生長的抑制率較高，通過響應面分析發現裝液量是顯著的影響因子，其次是發酵時間，而培養基初始pH值不顯著。方香玲[24]對致病桿菌TB菌株進行了RSM發酵優化發現，篩選出最佳培養基為蛋白胨，培養條件為發酵時間(54.07 h)，初始pH值(7.59)以及接菌量(9.95%)等3個因素，優化后提高了近73%，Wang等[25]對致病桿菌YL001菌株進行了RSM優化，確定了培養基最佳初始pH值7.64，裝液量10%，轉速220 r/min，接種量15%等，可達到最大的抗生素活性。

圖8 各因素交互作用下B. cinerea 抑制率響應面圖及等高線

4 結 論

最適培養基為TSY，最適培養時間為72 h，最適種子液為28 h，最適接菌量為5%，最適通氣量為50 mL/100 mL、180 r/min，最適pH值為7.00。該優化條件為：培養基初始pH值為7.12，裝液量56%，發酵培養時間為77 h，經驗證抑菌率為87.70%，比優化前提高了1.82倍。

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