DNA分子檢測技術定量評估捕食性天敵對棉蚜的控害功能

王冬梅，潘洪生，李海強，丁瑞豐，阿克旦·吾外士，劉 建，李號賓

(新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】害蟲防治的對策主要集中在有害生物綜合防治與害蟲生態調控[1]。充分利用自然天敵對害蟲的控制作用受到越來越多的關注[2-4]。運用以PCR技術為基礎的DNA檢測技術研究昆蟲的捕食作用，基于分子檢測的結果，為自然界中復雜的種間捕食關系提供參考依據，同時為田間天敵控害作用提供科學的證據。【前人研究進展】自然天敵對害蟲控制作用的評估方法主要包括田間系統調查、直接觀察法、標記法等，傳統方法只是定性研究，很難定量評價天敵與害蟲的捕食關系[5]。在綠盲蝽(Apolyguslucorum)體內成功檢測到棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)的DNA片段[6]；步甲等捕食性天敵對麥蚜[7]、鞍癭蚊(Haplodiplosismarginata)[8]具有捕食作用；異色瓢蟲(Harmoniaaxyridis)、草蛉、東亞小花蝽(Oriussauteri)等捕食性天敵中腸大豆蚜(Aphisglycines)的檢出率與大豆蚜的種群密度呈顯著正相關[9]。【本研究切入點】瓢蟲、草蛉和食蚜蠅等是新疆棉田的主要捕食性天敵，發生數量多、時間長，對蚜蟲、粉虱、螨類等害蟲具有很好的控制作用[10]。目前，利用DNA分子檢測技術定量評價新疆棉田捕食性天敵的控害作用報道較少[11]。需定量評價新疆棉田重要捕食性天敵對棉蚜的控害作用。【擬解決的關鍵問題】運用DNA分子檢測技術，測定棉田和苜蓿條帶捕食性天敵對蚜蟲的檢出率，評價捕食性天敵的控害作用及鄰近棉田苜蓿條帶對捕食性天敵的保育作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

2019～2021年，中棉所73號種植于中國農業科學院西部農業研究中心(44°15′37″，87°20′12″)，播種日期為每年的4月中旬，種植密度、水肥、縮節胺化控等管理采用當地常規管理技術，共種植3個棉花小區。在棉花旁邊種植寬度為2 m的苜蓿條帶。整個生長季棉田和苜蓿條帶均不施用任何化學農藥。

多異瓢蟲(Hippodamiavariegata)、方斑瓢蟲(Propylaeaquatuordecimpunctata)、菱斑巧瓢蟲(Oenopiaconglobata)、七星瓢蟲(Coccinellaseptempunctata)成蟲和幼蟲、草蛉類幼蟲、食蚜蠅類等捕食性天敵均采自種植在中國農業科學院西部農業研究中心的棉田和苜蓿條帶，單頭采集并立即放入裝有無水乙醇的1.5 mL離心管中，用Parafilm膜封口后放置于-20℃低溫冰箱保存，用于DNA分子檢測。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

每年5月下旬至8月中旬，采用斜線式5點取樣法，每隔7 d對每個小區中棉蚜種群數量進行調查，每點調查10株棉花，每個小區合計調查50株棉花。

1.2.2 分子檢測

不同捕食性天敵中腸DNA提取采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，操作步驟按照試劑盒說明。反應體系為20 μL，其中10×EasyTaqBuffer 2.0 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1.6 μL，上游引物(20 μm)0.3 μL，下游引物(20 μm)0.3 μL，EasyTaq(5 units/μL)0.2 μL，ddH2O 14.6 μL，DNA 模板 1 μL。PCR反應條件為94℃預變性3 min；94℃變性30s，退火30s，72℃延伸 1 min，共計40個循環；72℃延伸10 min。在含有EB(0.5 μg/mL)的瓊脂糖凝膠(1.0%)上進行電泳檢測，180 V電壓電泳20 min，電泳緩沖液為0.5×TBE。以標準分子量100 bp DNA Ladder作為參照物檢測擴增結果。表1

表1 棉蚜和三葉草彩斑蚜的引物序列和退火溫度

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 16.0對所有數據進行統計分析，其中棉蚜種群動態與捕食性天敵中腸棉蚜檢出率間的相關性采用Pearson相關系數分析。

2 結果與分析

2.1 棉蚜種群動態與捕食性天敵中腸檢出率間的相關性

研究表明，2019年，棉蚜種群數量6月底至7月初呈緩慢的上升過程，7月中旬后快速增長，于7月22日達到最高值，隨后迅速下降；捕食性天敵中腸棉蚜檢出率從采樣開始一直持續上升，7月22日達到最大值，然后緩慢下降，7月29日后快速下降。棉蚜種群數量與其在捕食性天敵中腸的檢出率間密切相關，回歸方程為Y=0.026 8X+26.282，其中P<0.000 1，R2=0.848 7，Pearson相關系數為0.921。圖1

2021年，棉蚜種群數量6月底開始逐漸上升，至7月14日達到最高值，隨后逐漸下降；捕食性天敵中腸棉蚜檢出率從采樣開始一直持續上升，至7月14日達到最高值，隨后緩慢下降，于8月初略有上升，然后緩慢下降。棉蚜種群數量與其在捕食性天敵中腸的檢出率間密切相關，回歸方程為Y=0.002 1X+33.811，其中P=0.001，R2=0.703 8，Pearson相關系數為0.839。圖2

圖1 棉蚜種群數量與捕食性天敵中腸檢出率的動態變化(2019年)

圖2 棉蚜種群數量與捕食性天敵中腸檢出率的動態變化(2021年)

2.2 棉田優勢捕食性天敵中腸棉蚜檢出率變化

研究表明，瓢蟲類幼蟲取食棉蚜數量較多，2019～2021年棉蚜檢出率分別為65.71%和59.02%，成蟲中多異瓢蟲取食棉蚜數量較多，檢出率分別為61.06%和50.24%；對于草蛉類幼蟲，棉蚜檢出率分別為56.03%和48.95%，多異瓢蟲是新疆棉田優勢捕食性天敵。捕食性天敵中腸棉蚜的檢出率2019年和2021年分別為60.26%和48.32%，捕食性天敵對棉蚜控制的貢獻度較大。表2

表2 不同捕食性天敵中腸棉蚜的檢出率

2.3 棉蚜和三葉草彩斑蚜在捕食性天敵中腸的檢出率變化

研究表明，6月棉蚜未檢出，7月和8月棉蚜檢出率分別為21.10 %和38.71 %，呈增長趨勢，而三葉草彩斑蚜在6月和7月的檢出率分別是52.50 %和73.70 %，呈上升趨勢，8月檢出率為27.95 %；對采自棉田的捕食性瓢蟲進行分子檢測，發現棉蚜在6月檢出率為18.11%，7月檢出率達75.52 %，直線上升，到8月下降，檢出率為49.53 %，而三葉草彩斑蚜在6月檢出率高達92.12 %，7月和8月呈直線下降分別是29.60 %和5.61 %。棉蚜未發生或數量較少時，瓢蟲以苜蓿條帶中的三葉草彩斑蚜為主，當棉蚜發生時，瓢蟲的取食以棲息生境的蚜蟲種類為主。表3

表3 棉蚜和三葉草彩斑蚜在捕食性天敵中腸的檢出率

3 討 論

新疆棉田中有多種害蟲的天敵，如瓢蟲、草蛉、食蚜蠅、寄生蜂等，對蚜蟲種群起到有效控制[12]。研究中，捕食性天敵的檢出率與棉蚜的種群數量具有顯著相關性，在害蟲的生物防治中起主導作用。

新疆棉田常見的捕食性瓢蟲主要有多異瓢蟲、方斑瓢蟲、菱斑巧瓢蟲等[10]。多異瓢蟲在棉田發生時間早、持續時間長、數量豐富、適應性強，對棉蚜具有較強的控制作用[13-15]。研究以不同捕食性天敵中腸中棉蚜的檢出率做定量分析表明多異瓢蟲為新疆棉田優勢種，與上述結果一致。而且，在天敵樣品采集時也發現多異瓢蟲在蚜蟲發生期均可采集到，方斑瓢蟲、菱斑巧瓢蟲和七星瓢蟲僅在7月中旬前采集到。

農田生境對天敵的生長發育、種群繁殖及其對害蟲的控制能力等都有重要影響[16]。可以為天敵提供花粉、花蜜等營養物質[17]，也可以為天敵提供取食棲息場所，如巨斑食蚜瓢蟲(Coleomegillamaculata)喜歡在鐵莧菜(Acalyphaostryaefolia)上產卵，而孵化出的幼蟲從鐵莧菜轉移到玉米上，促進了玉米上瓢蟲的種群發生，來控制玉米上的害蟲[18]。呂昭智等[19]、李雪玲等[20]、羅延亮等[21]通過田間調查也明確了棉田邊緣雜草帶對棉田天敵的保育作用。運用DNA分子檢測技術，對采自苜蓿條帶和棉田瓢蟲對不同蚜蟲的取食，當棉蚜尚未發生或數量較少時，捕食性瓢蟲主要在苜蓿條帶取食三葉草彩斑蚜，以獲取食物，苜蓿對瓢蟲早期的繁育具有保護作用。

瓢蟲又是一種多食性捕食天敵，可捕食多種獵物，當多種獵物共存時，瓢蟲對獵物，無明顯的捕食偏好性。在研究七星瓢蟲對松大蚜(Cinarapintabulaeformis)和棉蚜的選擇效應時，發現七星瓢蟲對棉蚜和松大蚜沒有明顯的捕食偏好，主要取決于2種蚜蟲的種群數量[22]。異色瓢蟲對蘋果綿蚜(Eriosomalanigerm)和繡線菊蚜(Aphiscitricola)的捕食偏好性試驗中發現，在2種蚜蟲為低密度時，異色瓢蟲對兩種蚜蟲均未表現出偏好性，而在2種蚜蟲處于高密度時，異色瓢蟲對繡線菊蚜表現出偏好性[23]。在棉蚜發生后，瓢蟲在棉田取食棉蚜，部分仍取食三葉草彩斑蚜，瓢蟲的取食還是主要以棲息生境的蚜蟲種類為主，未表現出明顯的偏好性。

刈割棉田邊的苜蓿，可有效利用天敵防治棉蚜[24]，2021年試驗表明，在6月中旬苜蓿刈割前，來自苜蓿條帶的瓢蟲檢測到取食三葉草彩斑蚜，而未檢測到棉蚜，來自棉田的瓢蟲分別可以檢測到三葉草彩斑蚜和棉蚜。而在苜蓿刈割后，棉田的瓢蟲檢測不到三葉草彩斑蚜。為有效利用棉田周邊生境中的天敵，要適時鏟除棉田周邊雜草。

DNA分子檢測技術的發展，為天敵與害蟲捕食關系的評價和分析提供了技術支撐，但DNA分子檢測技術也有其缺點[25]。在實際應用中需要運用多種方法，以獲得較為完整的信息，科學評價天敵與害蟲捕食關系。

4 結 論

采用田間種群系統調查棉蚜種群數量和DNA分子檢測技術定量分析，棉田棉蚜種群數量動態和捕食性天敵中腸棉蚜的檢出率密切相關；2019年和2021年，Pearson相關系數分別為0.921和0.839，比較以不同捕食性天敵對棉蚜的檢出率定量分析，2019年和2021年瓢蟲類幼蟲取食棉蚜檢出率分別為65.71%和59.02%，多異瓢蟲成蟲取食棉蚜檢出率分別為61.06%和50.24%，多異瓢蟲為新疆棉田優勢捕食性天敵；當棉蚜種群未發生或數量較少時，捕食性瓢蟲以取食苜蓿條帶中的三葉草彩斑蚜為主，當棉蚜和三葉草彩斑蚜同時發生時，捕食性瓢蟲以取食棲息生境的蚜蟲種類為主。利用DNA分子檢測技術可以定量評估捕食性天敵對棉蚜的控害功能作用。鄰近棉田邊緣的苜蓿條帶可以為捕食性天敵提供替代食物，對其具有重要的保育作用。

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