周期蛋白依賴激酶抑制因子3通過調控G2/M期檢查點促進肝內膽管癌細胞生長并降低對順鉑的敏感性

朱志文 陽亮芳 鄭楊 黃海麗 何惠娟

廣東醫科大學附屬醫院肝膽外科（廣東湛江 524001）

肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一種高致命性的上皮細胞惡性腫瘤，在肝臟原發性惡性腫瘤中約占10%～15%，發病率僅次于肝細胞肝癌。近年來ICC發病率不斷攀升，根治性手術切除是ICC的唯一潛在治療方法［1］。ICC極易向膽管壁浸潤并侵犯周圍肝組織，對于局部晚期或轉移性病灶的不可切除的患者，順鉑（DDP）聯合吉西他濱是當前治療晚期ICC的一線療法［2-3］。但化療耐藥性在ICC治療中已越來越普遍，已成為ICC治療失敗的主要原因［2-3］，因此尋找ICC治療的分子靶點對降低耐藥率和提升治療效果至關重要。

周期蛋白依賴激酶抑制因子3（cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3）位于染色質14q22.22，所編碼的蛋白質含有212個氨基酸殘基［4］。作為一種細胞周期蛋白依賴激酶（CDK）抑制劑，CDKN3能與CDK1/CDK2特異性結合并使其去磷酸化。其次，CDKN3可與MDM2和P53形成蛋白復合物，從而對P21產生抑制作用［5］。研究表明，CDKN3參與許多生物學過程，包括細胞周期轉化、DNA復制和DNA損傷修復等。目前，已在多種類型的癌癥中觀察到CDKN3表達增加，高水平的CDKN3與肺腺癌、食管鱗癌、胃癌和肝癌的預后不良密切相關［6-9］。最近的報告還顯示，CDKN3在促進腫瘤化療耐藥中也具有潛在作用，高水平的CDKN3可導致食管鱗癌和結腸癌細胞對DDP治療不敏感［10-11］。然而，CDKN3在ICC進展和化療敏感性中的作用尚未明確。

當前研究發現CDKN3在ICC組織中呈高表達，CDKN3參與ICC的發生發展和化療敏感性，其生物學功能與細胞周期的異常調控密切相關，表明CDKN3可作為ICC的一個有希望的治療靶點。總之，本研究結果以期為ICC的診斷、治療以及發病機制提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本收集 收集2018年10月至2021年12月在本院接受膽管癌根治手術患者的膽管癌組織及相應的癌旁組織25例，所有病例均有完整且詳細的病歷資料，本研究得到廣東醫科大學附屬醫院倫理委員會的批準（受理號：PJ2017066）［1］，并獲得每位患者及其家屬的知情同意。

1.1.2 細胞 人肝內膽管癌細胞HCCC-9810均購自中國科學院細胞庫。

1.1.3 試劑 DMEM培養基、血清FBS購自Gibco；培養皿購自耐斯生命科技公司；Transwell小室購自立沃生物科技公司；PVDF膜購自Millipore；免疫組化試劑購自中杉金橋；裂解液RIPA購自碧云天；干擾和過表達質粒購自上海吉凱基因公司；順鉑購自MCE；細胞周期檢測試劑盒（C1052）購自碧云天。

1.1.4 抗體 CDKN3（PA550929）購自Invitrogen；CDC25C（4688S）購自CST；p-CDK1（Thr14）（2543S）購自CST；β-actin（8457S）購自CST。

1.1.5 儀器 Tanon5200曝光機、Leica顯微鏡、BD FACSCantoⅡ流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 IHC免疫組化實驗 經4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片。實驗前65℃烤片30 min，脫蠟、水化。檸檬酸鹽修復液經微波爐高火抗原修復8 min，兩次。自然冷卻后，用內源性過氧化物阻斷劑避光孵育30 min，甩干滴加一抗（CDKN3抗體濃度為1∶100），4℃過夜。次日洗去一抗，滴加二抗孵育50 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加DAB顯影劑，純水終止顯影。蘇木素染液孵育2 min后流水返藍5 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。自然晾干后拍照。

1.2.2 細胞培養、轉染和DDP處理 HCCC-9810人肝內膽管癌細胞培養于含有10%Gibco胎牛血清和1%抗青霉素、鏈霉素的DMEM培養基中，放置于5% CO2濃度、37℃的恒溫培養箱內，待細胞處于生長對數期進行實驗。轉染前一天，HCCC-9810細胞以每孔2×105個接種于6孔板內，次日待細胞生長至孔板面積70%左右，按照轉染試劑說明書轉染陰性對照質粒、CDKN3敲低質粒以及CDKN3過表達質粒，Western blot驗證轉染效率。DDP處理時間為24 h，處理濃度為20 μmol/L。

1.2.3 生物信息學分析 分析來自GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的GSE26566數據集，該數據集包含104例膽管癌組織和59例與之匹配的非癌性肝臟組織的轉錄組信息。將GSE26566膽管癌樣本按CDKN3的中位表達量分為低表達組和高表達組，通過DAVID在線數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行 KEGG 富集分析和GO功能注釋。

1.2.4 細胞周期實驗 細胞周期實驗根據制造商的要求，按照說明書的步驟完成后使用BD FACSCantoⅡ流式細胞儀進行流式細胞術分析。

1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 對于克隆形成試驗，將轉染24 h的HCCC-9810細胞用胰酶消化，PBS清洗后接種在6孔板中，每孔500個細胞，每組均設置3個復孔，置于37℃、5% CO2濃度的恒溫培養箱中培養14 d后，用PBS輕輕清洗平板，多聚甲醛固定，并用0.1%結晶紫染色1 h，隨后流水沖洗，自然晾干后拍照。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將轉染24 h并處于對數生長期的細胞培養在6孔板中，各組細胞消化后接種于6孔板內，待24 h細胞鋪滿后用200 μL槍頭豎直劃痕，用PBS沖洗劃下的細胞，換液后拍照。在培養48 h時繼續拍照，用Image J軟件計算劃痕愈合率。

1.2.7 Westernblot免疫印跡實驗（WB） 收集細胞，用配制好的RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度后配平，煮沸使蛋白變性，按照40 μg上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜。第2天洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后顯影，用Tanon5200系統成像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法 所有實驗數據均由Graphpad 8.0軟件進行統計學分析和做圖，數據以（±s）表示。兩組間均值比較采用配對t檢驗以分析統計差異，Spearman相關性系數分析兩組數據的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDKN3在膽管癌組織中呈高表達 首先分析了GSE26566數據集中正常組織和膽管癌組織的CDKN3的表達情況，并將收集的膽管癌組織和癌旁組織進行免疫組化染色，數據集和免疫組化結果共同顯示，與周圍正常組織相比，膽管癌組織中的CDKN3表達顯著增加（P＜0.05，圖1A-B）。

圖1 CDKN3在ICC組織中被上調Fig.1 CDKN3 was upregulated in intrahepatic cholangiocarcinoma tissues

2.2 GO功能注釋和KEGG富集分析預測CDKN3在膽管癌中參與的途徑和生物學過程 將GSE26566的膽管癌樣本分為CDKN3低表達組和高表達組，進行基因代謝和功能的富集分析，結果見圖2A-B。共挖掘出1 431個正相關基因和1 643個負相關基因，KEGG富集分析顯示這些基因參與細胞周期信號通路的調控，GO功能注釋顯示這些基因主要參與細胞G2/M期轉換和有絲分裂等過程。

圖2 CDKN3參與調控細胞周期G2/M期轉化Fig.2 CDKN3 was involved in regulating drug metabolism and G2/M phase checkpoint

2.3 干擾CDKN3可通過誘導G2/M期阻滯抑制ICC細胞增殖和遷移 根據KEGG和GO富集分析提示，CDKN3共表達基因參與細胞周期G2/M期轉換。為驗證這一預測，首先通過質粒轉染的方式抑制細胞中CDKN3的表達，WB檢測質粒感染效率（圖3A），通過克隆和劃痕和實驗發現，沉默CDKN3后抑制了細胞增殖和遷移能力（P＜0.05，圖3B-C和表1［2］）。細胞周期實驗發現，與對照組相比，si-CDKN3組的HCCC-9810細胞在G2/M期比例明顯增高（P ＜ 0.05，圖3D和表1［3］），相應的G0/G1期細胞比例減少，而S期無明顯變化。為進一步探究其中的分子機制，首先通過STRING數據庫預測了CDKN3的蛋白互作網絡，發現CDKN3可與G2/M期檢查點蛋白CDC25C直接相互作用（圖3E）。并且分析了GSE26566數據集中CDC25C的表達情況，發現膽管癌組織中CDC25C的表達均明顯高于正常組織（P＜0.05，圖3F），隨后進一步分析了CDKN3和CDC25C在膽管癌組織中的相關性，結果顯示兩者之間呈正相關（P＜0.05，圖3F）。在干擾CDKN3后，通過WB檢測G2/M期檢查點蛋白的表達情況，結果顯示CDC25C表達被顯著降低，而CDK1低活性的磷酸化水平增加（P＜0.05，圖3G、表1）。以上結果均表明CDKN3通過影響膽管癌細胞G2/M期轉換，從而參與到膽管癌的發生發展中。

表1 轉染si-CDKN3對HCCC-9810細胞增殖、遷移、細胞周期和周期相關蛋白表達的影響的影響Tab.1 Effect of transfection of si-CDKN3 on proliferation，migration，cell cycle and cyclin expression of HCCC-9810 cells ±s

表1 轉染si-CDKN3對HCCC-9810細胞增殖、遷移、細胞周期和周期相關蛋白表達的影響的影響Tab.1 Effect of transfection of si-CDKN3 on proliferation，migration，cell cycle and cyclin expression of HCCC-9810 cells ±s

注：si-NC組與si-CDKN3組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組si-NC si-CDKN3細胞周期（%）G0/G1 47.73±1.07 38.41±1.41**S 44.98±0.38 46.35±1.19 G2/M 7.28±1.39 15.24±0.34**細胞克隆數目（個）175.0±12.49 122.7±6.03**細胞遷移率（%）64.16±4.09 47.37±3.94**周期蛋白相對表達CDKN3 1.05±0.12 0.39±0.09**CDC25C 1.06±0.14 0.72±0.16*p-CDK1 0.69±0.13 1.02±0.08*

圖3 干擾CDKN3可通過誘導G2/M期阻滯抑制ICC細胞增殖和遷移Fig.3 CDKN3 inhibition suppressd proliferation and migration of ICC cells by inducing G2/M arrest

2.4 CDKN3過表達降低膽管癌細胞對DDP治療的敏感性 細胞周期的異常調控在腫瘤細胞增殖和化療耐藥中發揮重要作用，推測CDKN3可能和膽管癌化療敏感性有密切聯系。通過克隆形成和劃痕等一系列細胞功能實驗，結果顯示，DDP處理組的膽管癌細胞其增值和遷移能力與對照組相比顯著降低，但過表達CDKN3后，膽管癌細胞的增殖和遷移能力得到了有效的挽救（P＜0.05，圖4A、4B和表2），證實了CDKN3能夠降低膽管癌細胞對DDP治療的敏感性。

圖4 CDKN3過表達可降低膽管癌細胞對DDP的敏感性Fig.4 Overexpression CDKN3 reduced the sensitivity of cholangiocarcinoma cells to cisplatin

表2 CDKN3對DDP治療的影響Tab.2 Effect of CDKN3 on DDP treatment ±s

表2 CDKN3對DDP治療的影響Tab.2 Effect of CDKN3 on DDP treatment ±s

注：NC組與NC+DDP組比較，NC+DDP組與CDKN3+DDP組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組NC NC+DDP CDKN3+DDP細胞克隆數目（個）183.7±17.50 75.0±9.54**119.9±15.10*細胞遷移率（%）67.11±4.39 31.43±5.20**50.46±6.16**

3 討論

ICC是僅次于肝細胞肝癌的第二常見原發性肝惡性腫瘤。隨著外科手術的進步，治療性切除已成為ICC最常見的治療方法，但由于2/3的腫瘤在診斷時已是局部晚期或轉移性病灶，因此很多不適合切除［12］。標準姑息性化療（吉西他濱和DDP）有利于ICC患者的總生存率，但中位生存期仍低于一年［3］。目前，導致ICC化療耐藥的分子機制尚未明確，因此，深入了解ICC增殖、遷移和化療耐藥的分子機制是當前的迫切需要。

CDKN3是一種周期蛋白依賴激酶抑制蛋白，正常情況下CDKN3負責CDK1/CDK2去磷酸化。盡管CDKN3對CDK1/CDK2具有負調節作用，傳統上被認為是細胞周期進程的負調節因子，但最近的研究發現，CDKN3的異常高表達與多種癌癥的發展進程有關，包括宮頸癌、食管鱗癌和前列腺癌等，高水平的CDKN3可導致不良的臨床預后［7，13-14］。而在不同類型的癌癥中CDKN3發揮的作用也不盡相同，究其原因可能是CDKN3下游作用的靶點不同導致。此外，CDKN3還可作為一些MicroRNA的下游靶點。在非小細胞肺癌中，miR-181d-5p通過靶向CDKN3抑制AKT通路激活，從而發揮抑癌作用［15］。MiR-127-3p則通過下調CDKN3/E2F1軸的活性，抑制腎細胞癌的增殖和轉移［16］。然而，CDKN3在ICC中的作用目前未曾有過報道，因此探究CDKN3與ICC發展進程的關系，將有助于更深一步了解ICC發病的分子機制，進而為ICC的臨床治療提供新思路。

在當前研究中，通過GEO數據庫和免疫組化結果，發現CDKN3在ICC組織中的表達較癌旁組織顯著升高。為進一步研究CDKN3在ICC中的生物學功能，首先進行了KEGG和GO富集分析，兩者結果一致表明與細胞周期相關的生物過程和途徑是共表達基因富集程度最高的原因，CDKN3可能參與ICC細胞周期G2/M期轉化。為驗證上述預測，用轉染質粒的方式干擾ICC細胞中CDKN3的表達，通過克隆和劃痕一系列功能實驗發現，抑制CDKN3的表達可有效減弱ICC細胞增殖和遷移能力，同時，細胞周期實驗表明，沉默CDKN3可顯著誘導G2/M期阻滯，這與富集分析預測的結果相一致。為進一步探究CDKN3調控G2/M期轉化的分子途徑，通過CDKN3的蛋白互作網絡發現，CDKN3可與CDC25C直接相互作用，以及相關性分析顯示CDKN3和CDC25C在膽管癌組織中的表達呈強正相關，我們推測CDKN3可能通過靶向CDC25C而發揮作用。后續的WB檢測發現，干擾CDKN3后CDC25C表達水平顯著降低，導致CDK1去磷酸化激活減少而低活性的磷酸化水平增加。CDC25C是細胞周期G2/M期的重要檢查點蛋白，CDC25C作用于CDK1 Thr14和Tyr15殘基并使其去磷酸化，CDC25C介導的CDK1去磷酸化和CyclinB1/CDK1復合物入核是調節細胞分裂起始的關鍵機制［17-18］。當 CDC25C活性受到抑制時，CyclinB1/CDK1復合物的活性也會受到抑制，因此CDC25C在控制細胞周期方面起著至關重要的作用［17-18］。最近的一些研究顯示，通過下調CDC25C/CDK1/CyclinB1信號軸，可有效誘導腫瘤細胞G2/M期阻滯，抑制癌癥進展［19-20］。因此，本研究結果得到了之前結論的有力支持。

越來越多的研究已表明，細胞周期的異常調控是腫瘤細胞化療耐藥的重要機制之一。有趣的是，ICC細胞在轉染CDKN3過表達質粒后，通過DDP治療發現，CDKN3過表達挽回了DDP對ICC細胞增殖和遷移能力的抑制作用，CDKN3顯著降低了ICC細胞對DDP治療的敏感性。之前已有研究發現，CDKN3能夠促進食管癌和結直腸癌細胞對DDP產生耐藥，抑制CDKN3后可恢復腫瘤細胞對DDP的敏感性［10-11］。最新的報告還指出，CDKN3通過調控LDHA依賴的代謝重編程，促進膀胱癌細胞對DDP抵抗，而抑制CDKN3的表達對克服膀胱癌化療耐藥具有潛在作用［21］。以上發現與本研究結果一致。

綜上所述，本研究探索了CDKN3在ICC發展進程中的生物學功能和作用機制，研究表明：CDKN3在ICC組織中高表達，與ICC發生發展密切相關；CDKN3沉默可通過下調CDC25C/CDK1軸引起G2/M期阻滯，從而抑制ICC細胞增殖和遷移能力；CDKN3過表達可有效降低DDP治療的敏感性，這可能是ICC細胞化療耐藥的潛在機制。總之，這些結果提示CDKN3是治療ICC的一個很有希望的靶點。