新疆南疆部分規模化羊場糞腸球菌的毒力基因及耐藥基因的檢測

邢瀟月，胡亞輝 ，張家浩，阿迪萊·卡哈曼，李蓮瑞★

（1. 塔里木大學動物科學與技術學院 843300；2.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室 843300；3.新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室 843300）

糞腸球菌屬于鏈球菌科、腸球菌屬，是人類和動物腸道中的正常菌群。它廣泛存在于自然界中，能夠在糞便中檢出，可以和其他胃腸道益生菌和諧共處[1]，并能夠產生L型乳酸和細菌素，抑制腸道微生物生長，具有維護動物和人腸道健康等作用。

但有時糞腸球菌又是機會致病菌，當宿主身體出現抵抗力下降，腸道內微生物失衡，就能引起動物疾病。糞腸球菌常引發人和動物的泌尿系統感染、腦膜炎、菌血癥等疾病[2]，據調查，近年來糞腸球菌引起動物和人類疾病的例子逐漸增多，在羊養殖業中危害也較大，對羔羊的致死率達到20%[3]。糞腸球菌由于細胞壁堅厚，具有天然的耐藥性，給藥物治療帶來一定困難。故對新疆南疆部分地區羊養殖場糞腸球菌的耐藥基因及毒力基因進行檢測，為新疆南疆部分規模化羊養殖場防控糞腸球菌提供一定基礎。

本實驗參考歐都·吾吐那生、齊亞銀、卜三平等[4]的糞腸球菌快速鑒定方法，篩選糞腸球菌，并用普通PCR方法檢測糞腸球菌是否攜帶耐藥基因及糞腸球菌。

1 材料

1.1 試驗材料

1.1.1 病料

在新疆巴音郭楞蒙古自治州、阿克蘇地區、喀什地區的部分規模化羊養殖場采集病羊、死羊的肺臟、肝臟、淋巴結、膽囊等組織，將采集組織放入-20℃保存。

1.1.2 生化鑒定試劑

精氨酸雙水解酶、產酸松三糖、產酸蔗糖、產酸棉籽糖、產酸甘露醇。

1.1.3 培養基

KF鏈球菌培養基，腸球菌培養基。

1.1.4 試劑

基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技北京有限責任公司。

2 方法

2.1 分離培養

將采集的病料切成1cm3大小的方塊，放入2mL離心管，并加入1顆鋼珠，放入研磨機中研磨3min；吸取10μL研磨好的漿液均勻滴在KF鏈球菌培養基上。37℃在電熱恒溫培養箱中培養±48h，挑出暗紅色至粉色菌落轉入腸球菌肉湯培養基，37℃培養±24h進行形態學觀察。

2.2 分離株的生化特性鑒定

將上一步獲得的可疑菌純培養物接種在精氨酸雙水解酶、產酸松三糖、產酸蔗糖、產酸棉籽糖、產酸甘露醇中[6]，37℃培養24h，根據反應現象能分辨鏈球菌和腸球菌。

2.3 tuf特異性基因擴增鑒定

嚴格按照北京天根生化科技有限公司的基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作，將提取的DNA于-20℃保存。

根據腸球菌的tuf[7]基因設計特異性引物（引物序列由上海生物工程有限公司合成）。PF：TACTGACAAACCATTCATGATG，PR：AACTTCGTCACCAACGCGAAC，預計擴增判斷大小為112 bp。特異性片段的擴增的條件：運用提取的DNA 為模板進行 PCR 擴增， 反應體系如下：DNA 模板1μL，PF（10μmol/L）0.5μL，PR（10μmol/L）0.5μL，PremixT a12.5μL，超純水 10.5μL，總體系為25μL。反應條件：預變性，94℃，3min；變性，94℃，30s；退火，55℃，30s；延伸，72℃，30s；循環數為30[8]，再延伸，72℃，10min。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶。

2.4 耐藥基因引物的合成及檢測

以2.3.1 提取的 DNA 為模板，參照文獻[11]設計引物，用PCR方法對糞腸球菌進行耐藥基因檢測，引物序列由上海生工合成。耐藥基因PCR反應條件[11]：tetM：95℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，45s；72℃,10min,30個循環。ermB：94℃，5min；94℃，30s；48℃，30s；72℃，45s；72℃，10min，30個循環。TEM：95℃，5min；94℃，30s；51℃，30s；72℃，45s；72℃,10min,30個循環。

表1 耐藥基因引物序列

2.5 毒力基因引物的合成及檢測

以2.3.1 提取的 DNA 為模板，參考文獻[12]設計引物，用PCR方法對糞腸球菌進行毒力基因檢測，引物序列由上海生工合成。

毒力基因 引物序列ylA F:ACTCGGGGA（5'-3'） 預計擴增片段大小（bp）C R:GCTGCT F:ACAGAAGATTGATAGGC AAGCTGCGCTT 688 hyl GCTGCAGGAAATG R:CACTGACGTCCAAGTTTCCAA 276 alas F:GCACGCTATTACGAACTATGA R:TAAGAAAGAACATCACCACGA 375

毒力基因PCR反應條件：CylA：94℃，5min；94℃,30s；54℃，30s；72℃，45s；72℃，10min；32個循環。Hyl：94℃，5min；94℃，30s；54℃，30s；72℃，45s；72℃，10min；32個循環。alas：94℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，45s；72℃，10min；32個循環。

3 結果

3.1 細菌分離培養結果

糞腸球菌為革蘭陽性球菌，呈球形或橢圓形，成對或鏈狀排列，結果見圖1。

圖1 革蘭染色鏡檢圖（10×100）

3.2 生化鑒定結果

選取5株疑似菌進行生化鑒定，除產酸棉籽糖為陰性，產酸松三糖為弱陽性，其他均為陽性，結果見表2。

表2 生化鑒定結果

3.3 鑒定結果

3.3.1 tuf基因鑒定結果

結果見圖2，可見目的基因大小為112bp，與預期大小相符。

圖2 tuf基因PCR特異性檢測

3.4 糞腸球菌耐藥基因檢測結果

對糞腸球菌進行3種耐藥基因擴增，其中大環內酯類ermB耐藥基因被檢出。如圖3。

圖3 ermB基因PCR產物電泳圖

根據結果顯示，大環內酯類耐藥基因ermB基因有51株，檢出率為47.2%。

3.5 糞腸球菌毒力基因檢測結果

對糞腸球菌進行3種耐藥基因擴增，其中alas耐藥基因被檢出。如圖4。

圖4 alas毒力基因PCR產物電泳圖

根據結果顯示，攜帶alas毒力基因的糞腸球菌有31株，檢出率為28.7%。

4 分析與討論

近年來，糞腸球菌作為機會致病菌對畜牧業的危害逐漸增大，原因是多方面的，首先，細胞壁堅厚等自身因素，使其具有天然的耐藥性；其次，抗生素的廣泛使用，也增強了糞腸球菌的耐藥性[12]。根據調查，新疆南疆地區對羊源性糞腸球菌不夠重視，導致發病率居高不下，嚴重危害羊養殖業發展，且新疆地區晝夜溫差大，飼養環境難控制，容易導致羊群抵抗力下降，給糞腸球菌可乘之機，侵入動物機體內，從而引起感染。本實驗探究新疆南疆地區糞腸球菌的毒力基因以及耐藥基因，為南疆地區治療糞腸球菌感染疾病提供一定基礎。本實驗采集新疆南疆地區部分規模化羊養殖場份病料進行分離鑒定，生化鑒定、并進行細菌的特異性tuf基因鑒定，共分離出108株糞腸球菌。對糞腸球菌進行4種耐藥基因以及4種毒力基因的檢測，其中四環素類tetM耐藥基因以及大環內酯類ermB耐藥基因被檢出，毒力基因alas被檢出，結果表明，新疆南疆部分規模化羊養殖場正在受糞腸球菌的侵害，并且這些糞腸球菌攜帶耐藥基因與毒力基因。

5 結論

糞腸球菌在南疆部分規模化羊養殖場中存在，并存在耐藥基因和毒力基因。