新疆北疆部分規模化牧場犢牛巴氏桿菌病調查

張 歡，勾耀鵬，胡朝輝，王晨豫，王 亮，齊亞銀★

（1.石河子大學動物科技學院 832003；2.新疆泰昆集團有限責任公司 831100；3.新疆天潤乳業股份有限公司 830000）

犢牛健康成長嚴重者影響牧場的發展情況。新生犢牛容易患消化道疾病和呼吸道疾病，而呼吸道疾病包括病毒病和細菌病、病毒病有牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感3型、牛呼吸道合胞體等。而細菌病包括巴氏桿菌、曼氏桿菌、肺炎鏈球菌等[1,2]。

牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種敗血性傳染病。急性經過主要以高熱、肺炎或急性胃腸炎和內臟廣泛出血為主要特征，呈敗血癥和出血性炎癥，故稱牛出血性敗血病，簡稱：牛出敗[3-5]。臨床上主要表現為三種型（敗血癥型（牛出敗）、水腫型、肺炎型）。帶菌動物是主要的傳染源，病原體存在鼻咽黏膜和扁桃體中（上呼吸道），通過被污染的飼料、飲水傳播[6]。牛巴氏桿菌病屬于條件致病菌，是犢牛呼吸道中的常在細菌，環境應激是造成本病暴發的重要因素[7]。通常不發病，一旦新生犢牛免疫力下降，受到外界冷熱應激、潮濕陰冷、牛舍簡陋、氨氣過重、通風不良、運輸應激等，極易發病。犢牛感染BVD、IBR后繼發感染多殺性巴氏桿菌病的病死率增加[8]。

本文為確定導致新疆北疆地區部分牧場犢牛多殺性巴氏桿菌的感染攜帶情況，采集犢牛鼻拭子使用特異性knt基因進行PCR檢測，為該牧場犢牛防控巴氏桿菌病提供科學的依據。

1 材料

1.1 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司。PCR儀購自賽默飛公司。移液器購自Eppendorf公司。

2 方法

2.1 樣品來源

2022年7月無菌采集北疆地區2個規模化牧場3月齡犢牛鼻拭子共計42份。將采集好的鼻拭子棉簽放入無菌的1.5mL的EP管中。記錄好編號快速放入裝有冰袋的采樣箱帶回實驗室。

2.2 樣品DDNA提取

在采集的鼻拭子1.5mLEP管中加入600 μLPBS，混勻，在-80℃反復凍融三次。DNA提取使用組織基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取鼻拭子DNA。具體步驟按照試劑盒說明書進行。

2.3 引物合成

根據參考文獻[9]中巴氏桿菌特異性基因kmt引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。

表1 巴氏桿菌kmt 特異性引物序列

2.4 PCR擴增

本實驗以提取的總DNA為PCR反應體系中的模板。反應體系如下表2。

表2 巴氏桿菌kmt特異性引物反應體系

使用PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳試驗。使用瓊脂糖凝膠成像儀觀察結果。

3 結果與分析

3.1 巴氏桿菌PCR調查結果

北疆部分地區兩個規模化牧場巴氏桿菌PCR調查結果：牧場一犢牛巴氏桿菌陽性率為23.8%（5/21）。牧場二犢牛巴氏桿菌陽性率為19.05%（4/21）。犢牛巴氏桿菌病總陽性率為21.42%（9/42）。結果見圖1，表3。兩個牧場犢牛均有不同程度的巴氏桿菌感染。且感染率較高，當犢牛免疫力下降時，牧場如不進行提前防控措施，可能會造成不可估量的損失。

表3 巴氏桿菌kmt特異性引物檢測結果

圖1 巴氏桿菌kmt特異性引物擴增結果電泳圖M:Marker;1-21鼻拭子樣品總DNA；

4 討論

規模化牧場中，犢牛是牧場發展的基礎。而巴氏桿菌病是新生犢牛極易發生的疾病，飼養不當，環境中攜帶致病菌，犢牛應激導致個體免疫力下降從而發病。應激包括熱應激，冷應激等。夏季防暑冬季保暖，落實新生犢牛初乳飼喂，加強牧場飼養管理，避免犢牛腹瀉給牧場帶來不必要的損失[10]。本試驗調查結果表明調查的牧場一犢牛巴氏桿菌陽性率為23.8%（5/21）。牧場二犢牛巴氏桿菌陽性率為19.05%（4/21）。犢牛巴氏桿菌病總陽性率為21.42%（9/42）。新疆北疆地區牧場犢牛均有不同程度的巴氏桿菌病的感染情況。巴氏桿菌作為牛呼吸道常在細菌，而誘發該細菌的條件較多，臨床上根據臨床癥狀鑒別較為困難，難與溶血性曼氏桿菌、支原體等疾病進行鑒別診斷，實驗室鑒別方法較多。通常以病毒病發病導致繼發感染，以混合感染的情況出現較為常見[11,12]。

巴氏桿菌的感染機制分為內源性感染和外源性感染，因此防控該細菌的主要兩個措施就是消除傳染源，切斷傳播途徑[13,14]。內源性感染：當各種原因導致牛的抵抗力下降時，寄生于呼吸道、消化道黏膜的多殺性巴氏桿菌趁虛而入，經淋巴液進入血液發生感染。防控內源性感染這情況主要是在于提高犢牛自身的免疫力，加強飼養管理，減少各種應激，避免犢牛抵抗力下降過低，繼而感染發病。外源性感染：多殺性巴氏桿菌能通過受損的呼吸道、消化道以及皮膚感染。防控該途徑主要是消滅傳染源，加大對飼養環境的消毒，犢牛接種疫苗后傷口進行消毒。避免犢牛傷口接觸繼而發生菌血癥等。

新生犢牛的免疫力較差，而巴氏桿菌可通過病菌可通過空氣飛沫、飲水、飼草等傳播，傳播途徑廣，群體發病率高，淘汰率、致死率高，臨床上一旦發現疑似巴氏桿菌感染，臨床癥狀表現明顯的立即單獨隔離飼養，查明病因，治療痊愈后再返回原飼養圈舍。巴氏桿菌易與其他呼吸道病原形成混合感染導致肺炎。對牛群危害極大[15]。

牧場治療該病主要以提高犢牛的免疫力結合使用巴氏桿菌敏感性藥物進行治療為該病的主要治療措施。具體為措施為新生犢牛做好飼喂初乳，飼喂時添加中藥制品黃芪多糖有較好的表現。使用泰拉霉素進行預防，取得了較好的臨床效果，3月齡以內的犢牛呼吸道疾病發病率顯著下降。3月齡以上的犢牛建議使用巴氏桿菌疫苗進行免疫。現階段巴氏桿菌疫苗已經非常成熟，3月齡以上犢牛首免一次，21d后加強免疫一次可有效防控巴氏桿菌病的出現。現階段因抗生素濫用導致細菌的耐藥性逐年增加，耐藥菌株增多，巴氏桿菌耐藥性也有不同程度的增強[16]。使用提高犢牛免疫力和疫苗免疫成為該疾病的主要防控措施。