水蔓菁揮發油的提取及抗氧化研究

韓 勇

（山西藥科職業學院，山西太原 030031）

植物揮發油又稱為植物精油（王建寶等，2011），是存在于植物中的次生代謝物（何敏等，2015），是一類揮發性油狀物質（吳迪等，2018）。植物揮發油已被廣泛應用于食品、醫藥、養殖、日用品等行業（鄧永飛等，2020；陳衛東等，2019；任澎等，2018；李冰等，2017）。其中具有抑菌、抗氧化、免疫調節等生物活性的植物揮發油，在食品、飼料等領域呈現出良好的發展潛力（王雪，2021；李娜等，2021；汪天龍等，2020）。

水蔓菁（Veronica linariifolia）是玄參科婆婆納屬的全草（李夢等，2019），味苦、性微寒（張子梅等，2011）。水蔓菁在民間有長期廣泛的食用和藥用習慣（張阜炳等，2019）。現有研究表明，其主要化學組成有揮發油、黃酮類、酚類化合物等成分，其中揮發油是水蔓菁的主要組成成分之一（韓勇，2021）。水蔓菁揮發油具有祛痰、鎮咳等活性（李峰，2002）。但目前對于其抗氧化的研究鮮見報道。研究表明，具有抗氧化性的揮發油用于動物養殖生產，可有效降低動物的氧化應激（溫鵬飛等，2017）。高油食品及油脂在食用前易氧化、水解而酸敗變質，因此需要使用抗氧化劑（周孟倩，2009）。本研究采用超聲波法提取水蔓菁中的揮發油成分，運用響應面試驗分析方法優化了水蔓菁揮發油的超聲提取工藝，并通過測定水蔓菁揮發油的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、總還原力，對超聲波法提取所得揮發油的抗氧化活性進行了評價，旨在為充分有效的利用水蔓菁揮發油資源提供試驗參考，并有望成為食品和飼料的新型天然抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 水蔓菁，采于山西省運城市萬榮縣。無水乙醇、無水硫酸鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、抗壞血酸、硫酸亞鐵、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等，均為分析純。

1.2 試驗儀器DXF-02C型手提式粉碎機，廣州市大祥電子機械設備有限公司；UV3000型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；FK124型電子分析天平，北京朗科興業稱重設備有限公司；TL-650CT多用途恒溫超聲波提取機，江蘇天翎儀器有限公司。

1.3 水蔓菁揮發油提取 使用粉碎機將水蔓菁粉碎成細粉，精確稱取10.0 g水蔓菁粉末置于提取燒杯中，按照液料比5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1（mL/g）加入無水乙醇，在提取溫度30、40、50、60、70、80℃下，用超聲波法提取，提取時間分別為20、30、40、50、60、70 min。提取液過濾，將濾液減壓干燥，加入無水硫酸鈉后過濾，得水蔓菁揮發油。將水蔓菁揮發油提取率作為試驗指標，研究評價超聲波提取法中的液料比、提取溫度和超聲時間對水蔓菁揮發油提取效果的影響。

通過響應面試驗分析方法中的Box-Behnken試驗設計，優化超聲波法提取水蔓菁揮發油的最佳條件。提取優化試驗的自變量為液料比（A）、提取溫度（B）和超聲時間（C），試驗的響應值為水蔓菁揮發油提取率（Y），響應面試驗設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計

使用Design Expert試驗分析軟件來分析優化響應面試驗數據，水蔓菁揮發油提取率（Y）為試驗指標，計算公式如下：

式中：m1為水蔓菁細粉質量，g；m2為水蔓菁揮發油質量，g。

1.4 抗氧化試驗

1.4.1 清除DPPH自由基 用無水乙醇配制成不同 濃 度 的 水 蔓 菁 揮 發 油 溶 液（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/mL），將3 mL水蔓菁揮發油溶液與3 mL DPPH試劑溶液在暗處充分混合，25℃下混合液避光反應30 min，在517 nm處測吸光值（A1），用無水乙醇代替DPPH試劑溶液，測吸光值（A2），用無水乙醇代替水蔓菁揮發油溶液，測吸光值（A0），抗壞血酸為陽性對照（敢小雙等，2018）。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

1.4.2 清除羥基自由基 取不同濃度的水蔓菁揮發油溶液2 mL，加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，2 mL 6 mmol/L的過氧化氫溶液，混勻后室溫靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，混勻后于50℃保溫30 min，在510 nm波長下測定其吸光度值（A1），用無水乙醇代替水楊酸，測吸光值（A2），用無水乙醇代替水蔓菁揮發油溶液，測吸光值（A0），抗壞血酸為陽性對照（李曉娟等，2021）。羥基自由基清除率的計算公式如下：

1.4.3 還原力測定 取不同濃度的水蔓菁揮發油溶液2 mL，加入2 mL pH為6.6的磷酸鹽緩沖液和2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后50℃保溫20 min，再加入2 mL質量分數為10%的三氯乙酸，混勻后3000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水和1 mL 0.1%的三氯化鐵，反應10 min后在700 nm波長處測吸光值，抗壞血酸為陽性對照（羅敏等，2018）。

2 結果與分析

2.1 揮發油提取單因素試驗

2.1.1 液料比對水蔓菁揮發油提取率的影響 由圖1可知，增加溶液的液料比，水蔓菁揮發油提取率不斷增加。液料比大于15:1（mL/g）后，提取率增加輻度較小，原因可能是溶液總量較多，揮發油的濃度相對下降，導致超聲波提取的效率降低，不能完全提取水蔓菁中的揮發油成分，因此確定提取液的液料比為15:1（mL/g）。

圖1 液料比對水蔓菁揮發油提取率的影響

2.1.2 提取溫度對水蔓菁揮發油提取率的影響由圖2可知，隨著提取溫度的升高，水蔓菁揮發油提取率持續增加，當溶液的提取溫度超過50℃以后，揮發油提取率增加不顯著，而且隨著溶液溫度的提高，增加了水蔓菁揮發油和乙醇的揮發量，也可能增加溶液中雜質的溶出，因而確定提取溫度為50℃。

圖2 提取溫度對水蔓菁揮發油提取率的影響

2.1.3 超聲時間對水蔓菁揮發油提取率的影響由圖3可知，當溶液的超聲時間為30 min時，水蔓菁揮發油提取率達最高值，繼續增加超聲時間，揮發油提取率將緩慢降低，可能是在超聲提取過程中，由于超聲時間增加，溶液的雜質溶出較多，從而影響揮發油的提取，因此確定超聲時間為30 min。

圖3 超聲時間對水蔓菁揮發油提取率的影響

2.2 響應面試驗 根據揮發油提取的單因素試驗結果，進行響應面的Box-Behnken設計分析優化試驗。分析優化試驗的結果見表2，優化試驗的方差分析結果見表3。

表2 Box-Behnke試驗結果

表3 Box-Behnke試驗方差分析

使用試驗分析軟件分析優化響應面試驗數據，獲得回歸模型方程：

回歸方程R2為0.9803，回歸模型P值<0.0 001為極顯著可靠，失擬項P值>0.05為不顯著，CV%為1.81，信噪比為20.171，均表明試驗模型的預測值與優化試驗值高度相關，所得回歸模型可用來分析優化水蔓菁揮發油的超聲波提取條件。由表2結果可知，在影響揮發油提取率的提取條件中，影響效果是提取溫度＞液料比＞超聲時間。

對響應面試驗分析方法所得回歸模型進行數據診斷，得模型數據診斷圖（圖4）。殘差正態概率見圖4A，試驗所得殘差沒有偏離方差，符合正態分布規律。殘差與預測值對應關系見圖4B，試驗殘差與模型預測值呈現無規律且較分散情況。殘差與運行數據對應關系見圖4C，試驗殘差與運行數據也呈現無規律且較分散情況，所有試驗數據的殘差范圍均在±3之內。預測值與試驗值對應關系見圖4D，模型預測值與實際試驗值對應關系良好，所得數據均接近直線分布。模型數據診斷圖充分表明回歸模型可靠性高，擬合程度好，可用來對水蔓菁揮發油的超聲波提取條件進行分析優化（張守花等，2021）。

圖4 模型數據診斷圖

根據回歸模型的數據分析，得到自變量交互作用的響應面試驗優化分析圖（圖5），反映了不同因素交互作用對揮發油提取率的影響。

圖5 響應面試驗優化分析圖

通過試驗分析軟件，得水蔓菁揮發油提取工藝的最優條件為液料比16.62:1（mL/g）、提取溫度52.63℃、超聲時間29.69 min。響應面試驗預測的揮發油提取率為1.14%。結合實際的超聲波提取工藝操作，將揮發油提取的最佳條件優化為液料比16.6:1（mL/g）、提取溫度53℃、超聲時間30 min。在此試驗條件下，進行3次揮發油提取平行試驗，揮發油平均提取率為1.13%。

2.3 抗氧化試驗

2.3.1 水蔓菁揮發油溶液對DPPH自由基的清除率試驗 由圖6可知，隨著揮發油濃度的增加，對DPPH自由基的清除率逐漸增強。當揮發油濃度為8 mg/mL時，清除率較高且穩定，當揮發油濃度為12 mg/mL時，清除率達到88.5%。但清除作用略小于抗壞血酸（Vc）。結果表明，水蔓菁揮發油在一定濃度下，對DPPH自由基有較強的清除能力。

圖6 清除DPPH自由基

2.3.2 水蔓菁揮發油溶液對羥基自由基的清除率試驗 由圖7可知，羥基自由基的清除率隨著揮發油濃度的增加而逐漸增強，當揮發油濃度為12 mg/mL時，清除率達到82.7%。結果表明，揮發油達到一定濃度時，對羥基自由基有較強的清除能力。與同濃度Vc相比較，揮發油對羥基自由基的清除率比Vc要略低。

2.3.3 水蔓菁揮發油還原力測定試驗 由圖8可知，水蔓菁揮發油具有較好的還原力，隨著揮發油濃度的持續增加，還原力也不斷增強。與同濃度Vc相比較，揮發油的還原力比Vc要略低，但揮發油在較高濃度時，也表現出良好的還原力。

圖8 還原力測定

3 結論

本試驗通過超聲波法對水蔓菁中的揮發油成分進行了提取分離，運用響應面試驗分析優化方法對揮發油提取條件進行了優化。得到最優的揮發油提取參數為液料比16.6:1（mL/g）、提取溫度53℃、超聲時間30 min，在此提取條件下，水蔓菁揮發油提取率為1.13%。抗氧化試驗結果表明，抗氧化活性隨著水蔓菁揮發油濃度的提高而增強，揮發油濃度為12 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為88.5%，對羥基自由基的清除率為82.7%，并表現出較強的還原力。超聲波法提取所得水蔓菁揮發油具有良好的抗氧化能力。