基于無(wú)抗養(yǎng)殖的發(fā)酵飼料的菌種選育研究

萬(wàn)映欣，張小藝，梁興英，李秀敏，童應(yīng)凱，李奕葶

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院 天津300384)

0 引 言

無(wú)抗養(yǎng)殖是指在養(yǎng)殖中不使用外源性藥物，如抗生素、激素等，以及動(dòng)物保健與防病采用物理、生物的措施，標(biāo)準(zhǔn)為肉質(zhì)好、口感佳、無(wú)殘留。如今，生物飼料已經(jīng)演變成為飼料行業(yè)中的一個(gè)新產(chǎn)業(yè)，并在發(fā)展中不斷完善，成為飼料產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中重要的組成部分[1]，在飼料無(wú)抗養(yǎng)殖、安全優(yōu)質(zhì)肉蛋奶產(chǎn)品供應(yīng)的發(fā)展過(guò)程中作用尤為重要。隨著生活水平提高，人們?cè)谧⒅匕踩耐瑫r(shí)也會(huì)更注重品質(zhì)和風(fēng)味。無(wú)抗養(yǎng)殖的核心元素是優(yōu)質(zhì)肉蛋奶，而現(xiàn)在我們最現(xiàn)實(shí)、最可行的選擇方案就是中藥無(wú)抗養(yǎng)殖。健康養(yǎng)殖最大的福利是生態(tài)養(yǎng)殖，而中國(guó)養(yǎng)殖最好的福利是中藥保健[2]，使用中藥對(duì)無(wú)抗養(yǎng)殖具有重要意義[3]。

本次試驗(yàn)以抗生素作為對(duì)照，采用打孔法探究黃連、黃芩、黃柏、大黃 4味中草藥復(fù)配并稀釋不同濃度后對(duì)所選5種菌種的抗菌性，以期篩選出抑菌效果較好的中草藥搭配，進(jìn)而為中藥抗菌產(chǎn)品的深入開(kāi)發(fā)研究提供一定的參考和借鑒[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 農(nóng)副產(chǎn)品

黃連、黃柏、黃芩、大黃(所有藥材均由天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，由中藥師審核發(fā)放)。

1.1.2 陽(yáng)性對(duì)照組產(chǎn)品

鹽酸特比萘芬片(齊魯制藥有限公司)、阿莫西林膠囊(中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司)。

1.1.3 供試菌株

大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及黑曲霉(Aspergillus niger)，均為天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

移液槍(濟(jì)南鑫露生物技術(shù)有限公司)；DHG-9078A恒溫箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；XFH-30MA高壓蒸汽滅菌鍋(浙江興豐醫(yī)療機(jī)械有限公司)；打孔器(深圳市良誼實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；BCM-1000A雙人雙面超凈工作臺(tái)(蘇州安泰生物技術(shù)有限公司)；ARC120電子天平(上海升隆科技有限公司)；JA2003電子分析天平(常州市中纖檢測(cè)儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物的制備

稱(chēng)取10.00g中藥粉末，轉(zhuǎn)入索式提取器，加5%乙醇，熱回流 1h；然后用離心機(jī)在 3000r/min下離心 15min進(jìn)行濃縮，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 60℃、150r/min旋轉(zhuǎn)濃縮至黏稠；放入 60℃烘箱烘至恒重。稱(chēng)取黃連、黃柏、黃芩、大黃提取物各 1.2g，然后分別加入 75%乙醇溶液和無(wú)菌水 12mL，配制成10mg/mL的乙醇溶液和水溶液的樣品溶液。三黃提取物(黃連、黃柏、黃芩)乙醇溶液和水溶液原液獲取方法同上。

1.2.2 陽(yáng)性對(duì)照組溶液的制備

將阿莫西林膠囊、鹽酸特比萘芬片研磨成粉末狀，然后分別稱(chēng)取125、62.5mg分別加入無(wú)菌水充分?jǐn)嚢?，?500mL容量瓶中定容，制成 25mg/L阿莫西林水溶液和 125、12.5mg/L濃度的鹽酸特比萘芬水溶液。

1.2.3 菌懸液制備

將上述各種待試菌用適宜斜面活化，以無(wú)菌水配制成106～107CFU/mL的菌液。

1.2.4 固體平板抗菌試驗(yàn)

用移液槍將制備好的菌懸液4mL添加到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，然后采用傾注法將充滿(mǎn)菌懸液的培養(yǎng)基倒入平板中，待其冷卻凝固后用直徑6mm的打孔器在平板上打孔4個(gè)。每孔內(nèi)加入50μL藥液，分別將濃度為 250、25mg/L的阿莫西林溶液添加到細(xì)菌培養(yǎng)基中，將濃度為 125、12.5mg/L的鹽酸特比奈芬溶液添加入培養(yǎng)酵母菌和霉菌的固體培養(yǎng)基中，添加三黃、四黃提取物的3個(gè)孔的濃度分別為原液、10mg/L稀釋溶液。每個(gè)培養(yǎng)皿做2個(gè)平行。恒溫箱培養(yǎng)待抑菌圈形成后觀(guān)測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果和分析

2.1 三黃對(duì)細(xì)菌的平板抑菌結(jié)果

由表1、2可見(jiàn)，在細(xì)菌中，不同濃度的阿莫西林在細(xì)菌中抑菌圈直徑很接近，表明在這2個(gè)濃度下阿莫西林對(duì) 3種菌的抑菌作用相差不大。濃度為100mg/L的三黃 75%乙醇浸提和無(wú)菌水浸提溶液在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的抑菌圈直徑接近，藤黃微球菌的抑菌圈直徑小于前2個(gè)菌，表明在這個(gè)濃度下，對(duì)于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果大于藤黃微球菌，溶劑對(duì)三黃中藥的抑菌效果不明顯；濃度為 10mg/L的三黃 75%乙醇浸提和無(wú)菌水浸提溶液在3個(gè)菌中均未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，分析原因可能為加樣濃度不夠。結(jié)果表明陽(yáng)性對(duì)照阿莫西林對(duì)這3種菌有很強(qiáng)的抗菌作用，且抑菌效果大于三黃中藥，而三黃中藥對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果要強(qiáng)于藤黃微球菌。

表1 三黃 75%乙醇浸提溶液對(duì)不同細(xì)菌的抑菌圈直徑(單位：mm)Tab.1 Diameter of inhibition zone of Sanhuang 75%ethanol extract on different bacteria(unit：mm)

表2 三黃無(wú)菌水浸提溶液對(duì)不同細(xì)菌的抑菌圈直徑(單位：mm)Tab.2 Diameter of inhibition zone of Sanhuang sterile aqueous extract on different bacteria(unit：mm)

2.2 四黃對(duì)細(xì)菌的平板抑菌結(jié)果

由表3、4可見(jiàn)，在細(xì)菌中，阿莫西林為對(duì)照，濃度為100mg/L的四黃75%乙醇浸提和無(wú)菌水浸提溶液在 3種菌中的抑菌圈直徑接近，但四黃 75%乙醇浸提溶液的抑菌圈小于無(wú)菌水浸提溶液，表明抑菌效果微弱于無(wú)菌水浸提溶液，但兩者對(duì)3種菌均有抑菌效果，且整體小于陽(yáng)性對(duì)照的抑菌性；濃度為10mg/L的三黃 75%乙醇浸提溶液和無(wú)菌水浸提溶液，在 3種菌中均未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，分析原因可能為加樣濃度不夠。

表3 四黃 75%乙醇浸提溶液對(duì)不同細(xì)菌的抑菌圈直徑(單位：mm)Tab.3 Diameter of inhibition zone of Sihuang 75% ethanol extract on different bacteria(unit：mm)

表4 四黃無(wú)菌水浸提溶液對(duì)不同細(xì)菌的抑菌圈直徑(單位：mm)Tab.4 Diameter of inhibition zone of Sihuang sterile aqueous extract on different bacteria(unit：mm)

2.3 三黃、四黃浸提溶液對(duì)釀酒酵母的抑菌結(jié)果

由表5、6可見(jiàn)，其中陽(yáng)性對(duì)照鹽酸特比萘芬無(wú)抑菌圈，可推斷出此次試驗(yàn)結(jié)果有一定的誤差，有可能是試驗(yàn)過(guò)程中稱(chēng)量誤差或藥品不純而導(dǎo)致藥品濃度過(guò)低，因而平皿中未出現(xiàn)抑菌圈。在本組試驗(yàn)中，由抑菌圈直徑大小可看出三黃浸提溶液的抑菌效果比四黃浸提溶液要強(qiáng)，而浸提溶劑對(duì)三黃、四黃浸提溶液在釀酒酵母中的抑菌性影響不大。

表5 三黃、四黃 75%乙醇浸提溶液對(duì)釀酒酵母的抑菌圈直徑(單位：mm)Tab.5 Diameter of inhibition zone of 75% ethanol extract of Sanhuang and Sihuang on Saccharomyces cerevisiae(unit：mm)

表6 三黃、四黃無(wú)菌水浸提溶液對(duì)釀酒酵母的抑菌圈直徑(單位：mm)Tab.6 Diameter of inhibition zone of Sanhuang and Sihuang sterile aqueous extracts on Saccharomyces cerevisiae(unit：mm)

2.4 三黃、四黃對(duì)黑曲霉的平板抑菌結(jié)果

由表7、8可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照鹽酸特比萘芬對(duì)黑曲霉的抑菌效果很明顯，黑曲霉對(duì)鹽酸特比萘芬極其敏感。三黃、四黃的 75%乙醇浸提和無(wú)菌水浸提溶液對(duì)黑曲霉的抑菌效果不明顯，幾乎沒(méi)有。在本組試驗(yàn)中，黑曲霉未出圈可能是加樣時(shí)未達(dá)到有效濃度而產(chǎn)生誤差所致。

表7 三黃、四黃 75%乙醇浸提溶液對(duì)黑曲霉的抑菌圈直徑(單位：mm)Tab.7 Diameter of inhibition zone of 75% ethanol extract of Sanhuang and Sihuang on Aspergillus niger(unit：mm)

表8 三黃、四黃無(wú)菌水浸提溶液對(duì)黑曲霉的抑菌圈直徑(單位：mm)Tab.8 Diameter of inhibition zone of Sanhuang and Sihuang sterile aqueous extracts o Aspergillus niger(unit：mm)

2.5 三黃、四黃浸提溶液對(duì)所有菌種的抑菌性條形圖分析試驗(yàn)結(jié)果

浸提溶液對(duì) 4種菌的抑菌效果如圖1所示。三黃、四黃無(wú)菌水浸提溶液對(duì)細(xì)菌的抑菌性效果明顯強(qiáng)于 75%乙醇浸提溶液，而對(duì)釀酒酵母的抑菌性稍弱于 75%乙醇浸提溶液，可見(jiàn)溶劑對(duì)三黃、四黃中藥的抑菌性影響不大；在細(xì)菌中，四黃浸提溶液的抑菌性強(qiáng)于三黃浸提溶液；在酵母菌中，三黃浸提溶液的抑菌效果更好。

圖1 不同濃度中藥對(duì)4種供試菌效果對(duì)比圖Fig.1 Comparison of effects of different weight Chinese herbs on four tested bacteria

3 結(jié)論和討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，三黃、四黃浸提溶液對(duì)細(xì)菌、酵母菌、霉菌三大類(lèi) 5種菌種都具有抑菌性，但其抑菌性整體都弱于陽(yáng)性對(duì)照。三黃、四黃浸提溶液在低濃度時(shí)均沒(méi)有抑菌圈；阿莫西林在所選用的3種細(xì)菌中的抑菌圈直徑達(dá) 16.1～28.0mm；鹽酸特比萘酚對(duì)酵母菌的抑菌圈直徑達(dá) 14.9～19mm；鹽酸特比萘酚對(duì)黑曲霉的抑菌圈直徑達(dá) 19.1～28.2mm；三黃 75%乙醇浸提溶液對(duì)以上 4種菌的抑菌圈直徑依次為12.2、13.0、9.0、19.0mm；三黃無(wú)菌水浸提溶液對(duì)以上 4種菌的抑菌圈直徑依次為 20.1、19.5、12.3、18.2mm；四黃75%乙醇浸提溶液對(duì)以上4種菌的抑菌圈直徑依次為 10.8、11.0、10.6、16.0mm；四黃無(wú)菌水浸提溶液對(duì)以上4種菌的抑菌圈直徑依次為13.1、13.3、13.5、14.9mm。

通過(guò)上述研究結(jié)果可以得出，在本次研究所采用的材料中，三黃 75%乙醇浸提溶液在黑曲霉中所表現(xiàn)出來(lái)的抑菌性最強(qiáng)，這種組合視為本次實(shí)驗(yàn)研究的最佳方案。

無(wú)抗養(yǎng)殖主要是指利用中藥作為對(duì)抗生素的治療和處理手段，以此達(dá)到動(dòng)物的肉質(zhì)中完全沒(méi)有抗生素存在的目的。生物發(fā)酵飼料以雜糧等為原材料，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且具有價(jià)格低廉、口感良好、抗生素含量低等優(yōu)勢(shì)，可為無(wú)抗養(yǎng)殖的研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。多種“藥食同源”藥材既有抗菌功能，且通過(guò)恰當(dāng)?shù)呐湮槟苄纬蓞f(xié)同增效的作用，這也將為無(wú)毒副作用和無(wú)刺激性抗菌藥的研究提供依據(jù)[5]。

不同中藥提取物的抗菌活性也各不相同，但這些中藥提取物對(duì)細(xì)菌、真菌等均有一定的效果[6]。中醫(yī)藥提煉方式涵蓋了水煎法、浸漬法、回流提取法、溶液提煉法、水汽蒸餾法等傳統(tǒng)方式，還涉及了半仿生提純法、酶輔助提純法、超聲提取法、閃式提取法、微波法和CO2超臨界流體提煉法等萃取新技術(shù)[7]；將提煉中藥的溶液分為清水、甲醇、乙醚等；萃取中藥的溫度差異也會(huì)對(duì)其抑菌功效有影響。本試驗(yàn)為了簡(jiǎn)便，所采用的方式相對(duì)簡(jiǎn)單，只采用了以無(wú)菌用水、酒精為溶液的回流式萃取法，能夠很好地呈現(xiàn)出黃連、黃柏、黃芩、大黃4種中藥提取液的抑菌效果。其次，在中藥萃取方式上，體外抑菌試驗(yàn)實(shí)際上受到諸多外部因素的影響，因此，其抗菌性能并不佳。

綜上所述，本試驗(yàn)僅僅對(duì)最佳抑疫配方進(jìn)行了初步的篩選，以后需要再對(duì)不同菌株的最優(yōu)預(yù)測(cè)配方進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)研究，以期為今后投入生產(chǎn)無(wú)抗飼料的新產(chǎn)品提供可靠依據(jù)。