原位冷凍光電關聯技術的研究進展

盧 婧，李尉興，徐曉君，紀 偉

（中國科學院生物物理研究所, 北京 100101）

1 引 言

細胞是所有生物的基本功能單位，而細胞功能很少由單一種類的分子完成，大多數細胞功能起源于細胞內不同種類分子之間的相互作用，很多重要的分子復合體根植于它們所在的細胞環境中，無法在不破壞其結構完整性的同時將它們剝離出來。因此，在細胞原位對生物大分子進行觀察和結構解析，研究生命活動和疾病入侵的分子機理，既有助于揭示生命現象本質，也關系到國家生物安全、醫藥衛生、農業和綠色產業發展等重大戰略需求。

冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）是在細胞原位解析生物大分子結構的核心技術[1]。在該過程中，細胞樣品被迅速冷凍固定（通常是液氮溫度-196°），其中的水跳過結晶態直接進入玻璃態，因此，細胞中的細胞器和大分子復合體得以維持其原始位置和形態；樣品制備完成后，送入冷凍透射電鏡，通過將樣品傾斜不同角度，采集一系列的二維圖像，重建出樣品的三維圖像，可以得到0.1納米量級的分辨率。然而，cryo-ET要應用于細胞原位檢測，還面臨3個技術難點：第一，受限于電子穿透深度，樣品厚度需要小于300nm[2]，大多數細胞樣品無法直接成像；第二，電鏡圖像的襯度來源于樣品質量密度分布，而細胞內環境非常嘈雜，很難精確定位所需的生物大分子[3]。第三，很多生物過程在細胞中呈稀疏分布，無法單純根據電鏡圖像定位。因此，要在細胞原位進行cryo-ET成像，需要精確定位目標區域，并將樣品減薄到300 nm以下。

聚焦離子束（FIB）減薄是目前最有前景的冷凍樣品減薄方式[4]，FIB通常集成在掃描電鏡（SEM）腔室內。聚焦至納米量級的離子束（常用Ga+離子）接觸樣品表面后，會濺射出部分樣品，并氣化為二次離子或是中性原子，從而實現對樣品的切割減薄。通過將離子槍和樣品設置成一定角度，并對細胞中感興趣區域上下表面進行切割減薄，可以得到透射電鏡所需要的300 nm以下的平整薄片樣品[5-6]，再將制備好的薄片樣品通過冷凍傳輸系統送入冷凍透射電鏡進行斷層掃描成像。由于生物樣品中大多數都是碳、氫、氧等輕原子，為了避免樣品切割范圍外的表面損傷，離子束減薄時的電流很小，相應也會花費更長的時間；樣品從掃描電鏡腔室轉移到透射電鏡腔室，需要全程處于低溫低濕狀態，同樣費時良久，且樣品有一定的污染概率。綜上所述，FIB雖然可以將冷凍細胞樣品減薄到300 nm以下，但為了提高透射電鏡樣品制備成功率，需要精確高效地定位目標分子所在區域。

熒光顯微成像可以通過用染料或熒光分子標記細胞中特定的蛋白或者亞細胞結構，實現對生物大分子和分子復合物的定位及對其生物過程的觀測。將熒光顯微鏡和電鏡結合起來的方式被稱為冷凍光電關聯顯微成像（cryo-CLEM），將熒光顯微鏡對目標分子的定位優勢和電鏡的分辨率優勢相結合，通過光鏡圖像和電鏡圖像的配準，在復雜的細胞環境中定位感興趣的細胞器或分子復合物，并在原位對其進行觀察和解析。為了保證光電關聯圖像精確配準，細胞冷凍需要在光鏡成像之前進行，因為在冷凍過程中可能出現樣品載網變形，導致細胞形態變化，而且對于活細胞來說，在光鏡成像到原位冷凍期間，內部結構功能也會發生改變。

2 原位冷凍光電關聯成像概述

cryo-CLEM成像流程通常如圖1（彩圖見期刊電子版）所示，首先將生物細胞培養在電鏡載網上（圖1（a）），并對細胞中感興趣的結構或過程進行熒光標記（圖1（b）），再將載網迅速降低到液氮溫度以下（圖1（c）），然后將樣品轉移到冷凍光鏡中進行熒光成像，并選擇需要減薄的目標位置（圖1（d）），接下來，將樣品傳輸到FIB-SEM雙束電鏡下，將光鏡圖像和電鏡圖像進行關聯，并將目標位置FIB減薄到300 nm以下（圖1（e）），最后將樣品轉移到透射電鏡下進行cryo-ET成像（圖1（f））。

圖1 原位冷凍細胞光電關聯成像示意圖。（a）細胞培養；（b）熒光標記；（c）原位冷凍；（d）光鏡成像；（e）FIB減薄；（f）cryo-ET成像Fig. 1 Schematic diagram of cryo-CLEM. (a) Cell culturing; (b) fluorescent labeling; (c) fast freezing; (d) fluorescent imaging; (e) FIB milling; (f) cryo-ET imaging

冷凍熒光成像可以精確定位標記生物分子的位置，可是僅對熒光標記的分子種類敏感，缺乏詳細的細胞背景，而冷凍電鏡則對生物樣品中所有分子的電子密度敏感，能夠提供詳細的細胞背景，但它缺乏廣泛適用的、特異性強的標記方法。Cryo-CLEM結合了熒光圖像的特異性標記，以及電鏡圖像的電子密度敏感特性，是一項發展迅速的新興技術。已經成功用于觀測植物細胞中的自噬體[7]、動物細胞中的微管等細胞骨架[8-9]、多層膜結構[10-11]、酵母菌中的質膜隔室[12]和蛋白自噬機制[13]、果蠅腦神經[14]以及神經細胞突觸[15]等。

3 原位冷凍技術

為了在cryo-ET下實現生物大分子的結構解析，細胞的原位冷凍固定是樣品制備的第一個技術難點。如果將生物樣品緩慢降溫，其中的水會形成結晶態的冰，結晶態的冰會導致電子束發生散射，不僅會降低透射電鏡圖像對比度，還會破壞細胞中分子復合物的結構。因此，為了避免細胞中的水在降溫過程中出現結晶態，需要使細胞中的溫度迅速降低，形成一種玻璃態的冰，這種冰對電子束來說是透明的，不會影響電鏡圖像質量，而且能完整保存細胞中分子復合物的結構，這就是原位冷凍技術[16]。

目前，根據樣品的厚度和種類，原位冷凍技術主要分為快速冷凍和高壓冷凍兩種?？焖倮鋬黾夹g主要應用于厚度小于15 μm的樣品，其原理是將鋪設了樣品的電鏡載網固定在栓塞上，通過重力驅動將載網迅速浸入冷卻腔室，此時腔室中注滿了由液氮冷卻的乙烷或者乙烷和甲烷的混合物，通過熱傳導對生物樣品進行快速冷凍，這些液體的高熱容量、較高的沸點和導熱性可以保證冷卻速度。很多商用的快速冷凍儀器可以實現自動化冷凍控制和環境參數調節，極大地提高了生物樣品的制備效率。例如：FEI公司推出的VitrobotTM系列（圖2（a）），Gatan公司的CP3系列（圖2（b））等。

而對于超過15 μm厚的細胞樣品或者組織樣品，由于水本身的導熱性較差，無法通過快速冷凍技術實現整個樣品的快速降溫，故需要采用高壓冷凍固定（HPF）的方式[17]。當環境壓力增加時，水的融化溫度降低，而高壓冷凍固定技術可以在幾毫秒的時間內對樣品施加2×108Pa壓力，將水的融化溫度降低至-40 °C。高壓冷凍固定技術通過降低水的冰點避免形成冰晶，其可以使～250 μm厚度的樣品均勻玻璃化[18]。常用的商用高壓冷凍儀包括Leica公司的EMPact系列（圖2（c）），Bal-Tec公司的HPM系列等（圖2（d））。

圖2 商用原位冷凍設備。（a）FEI公司VitrobotTM；（b）Gatan公司CP3；（c）Leica公司EMPact；（d）Bal-Tec公司HPMFig. 2 Commercial plunge freezers and high pressure freezers. (a) VitrobotTM from FEI; (b) CP3 from Gatan; (c) EMPact from Leica; (d) HPM from Bal-Tec

4 原位冷凍光電關聯系統

4.1 冷凍樣品臺技術

冷凍光鏡和冷凍電鏡的關聯，依賴于高穩定性的冷凍樣品臺。此外，對冷凍光鏡的物鏡也有特殊需求：首先，冷凍光鏡的物鏡大多使用空氣物鏡，因為絕大多數商用油浸顯微物鏡都不適用于低溫；其次，物鏡的工作距離應該盡量長，因為物鏡相對于樣品的溫度更高，如果距離樣品太近，會導致樣品結晶或是物鏡發生損傷；最后，為了達到更高的分辨率，物鏡的數值孔徑需要盡量大。世界上第一臺用于原位冷凍細胞熒光成像的冷凍樣品臺（簡稱“冷臺”）由Sartori等人開發，并放置于一個倒置的光學顯微鏡上[19]。隨后，他們和FEI公司合作開發了第二代冷臺，并于2010年發布。這個冷臺可以使用工作距小于2 mm的顯微物鏡，冷臺中的自動液氮泵可以保證EM載網上的樣品處于玻璃態，其一次最多可以加載4個樣品載網。同時，Schwartz等人開發了一臺可放置于正置光學顯微鏡上的冷凍樣品臺[20]，隨后和Instec公司合作開發了CLM77K系列冷臺（圖3（a）），為了確保樣品不升溫，該冷臺只能使用工作距為5 mm以上的顯微物鏡。Linkam公司也在同期開發了適用于多數正置光學顯微鏡的冷臺CMS196（圖3（b）），在該冷臺中，內置液氮杜瓦瓶的設計使得冷臺不需要連接液氮泵，同時可對顯微物鏡進行降溫，使得CMS196可以使用NA為0.9，工作距離僅有300 μm的顯微物鏡。Leica公司基于Schorb和Brigg的工作[21]，開發了商用冷臺。該冷臺通過斷開液氮罐和冷臺的直接連接，減少了氮氣沸騰和泵送過程中產生的震動。針對冷凍熒光成像，Leica公司還開發了適用于低溫工作的空氣物鏡，在物鏡前端使用熱導率較低的陶瓷材料，使得物鏡的NA可達0.9，工作距離僅有280 μm。2016年，FEI公司開發了適用于倒置顯微鏡的冷臺CorrSight（圖3（c）），可以使用NA為0.9的物鏡，由于物鏡和樣品被一個玻璃窗口片隔開，該冷臺可以使用任意工作距離大于410 μm，且經過標準蓋玻片校正的商用空氣物鏡。

圖3 幾種商用冷臺和冷臺樣機實物圖。（a）Instec公司的CLM77K；（b）Linkam公司的CMS196；（c）FEI公司的CorrSight；（d）Li等人提出的高穩定性冷臺[19]；（e）徐濤組提出的高穩定冷臺[20]Fig. 3 Commercial cryo stages and prototypes. (a) CLM77K from Instec; (b) CMS196 from Linkam; (c) CorrSight from FEI;(d) Cryo stage proposed by Li[19]; (e) Cryo stage proposed by Xu[20]

上述冷臺存在的一個共同問題：較低的溫度穩定性和機械穩定性。為了解決這個問題，研究者提出將換樣機構和冷臺的溫度同機械穩定性耦合，以提高冷臺的穩定性，進而提高光鏡成像分辨率和敏感度。但是這種設計對物鏡工作距離有較高要求[22-24]。Hessel等人設計的冷臺采用了長工作距物鏡，可以在液氦溫度（1.6 K）下使用，光路相對簡單，但是如果采用高NA物鏡，會引起很大的球差和色差[24]。Li等人提出的冷臺結構如圖3（d）所示，將物鏡放置在冷臺外的室溫中，物鏡和冷臺之間用光學窗隔開，因此，需要采用更長工作距離的物鏡，其能使用的最大NA物鏡是0.7[22]。國內方面，中國科學院生物物理研究所的徐濤課題組在2018年報道了一臺具備極高的溫度穩定性（＜0.06 K/10 h）和機械穩定性（＜200 nm/5 h）的冷臺（圖3（e）），使用的商用物鏡的NA為0.8，工作距離為3 mm，其采用該冷臺實現了單分子定位成像[23]。

4.2 原位冷凍光電關聯成像系統

根據原位冷凍光鏡相對于電鏡的位置，可以將cryo-CLEM成像系統分成兩類，一類是分體式cryo-CLEM系統（圖4（a）），其冷凍光鏡獨立于FIB-SEM電鏡，樣品在冷凍光鏡下成像后，通過冷凍傳輸系統傳輸到電鏡真空腔室內，再進行電鏡成像和FIB切割減薄，減薄后的樣品薄片再經由冷凍傳輸到cryo-ET中；另外一類是嵌入式冷凍光電關聯系統，其光鏡部分嵌入電鏡腔室內，冷凍樣品在光鏡下成像后直接在真空腔室切換到電鏡下成像，而且在FIB切割減薄過程中，可以隨時將樣品移動到光鏡成像位置，樣品薄片制備完成后，再通過冷凍傳輸到cryo-ET中。

圖4 （a）分體式cryo-CLEM的成像系統示意圖；（b）分體式cryo-CLEM的成像流程Fig. 4 (a) Schematic diagram and (b) flow chart of imaging process of independent cryo-CLEM system

4.2.1 分體式冷凍光電關聯成像系統

如圖4（b）所示，分體式冷凍光電關聯成像流程如下：首先，在電鏡載網上培養細胞和熒光標記；然后，將載網放入冷凍設備中進行快速冷凍或高壓冷凍；接下來，通過冷凍傳輸將樣品傳到冷凍光鏡中進行光鏡成像，再通過冷凍傳輸將樣品傳入FIB-SEM中，關聯光鏡和電鏡圖像，并用FIB切割減??；最后，將樣品冷凍傳輸到冷凍透射電鏡中，進行cryo-ET成像[22]。由于冷凍光鏡獨立于FIB-SEB雙束電鏡，可以采用更復雜的光路結構，引入各種超分辨成像模態[23]。

冷凍樣品的光學超分辨成像仍然是一個較新的領域：一方面，熒光分子的光漂白（photo-bleaching）和光分解(photo-decomposition)效應在低溫下會大大降低，甚至消失[19,24]；另一方面，有些熒光蛋白的光轉換（photo-switching）能力消失，有些雖然存在，也和室溫下的條件差異很大；另外，很多超分辨方法需要使用較高的激光強度，可能會使樣品局部升溫，生成冰晶，導致生物樣品損壞。下面介紹一些已經應用于冷凍樣品成像的超分辨成像技術，如圖5（彩圖見期刊電子版）所示。

冷凍受激發射耗盡顯微術（cryo-STED）采用兩路激光同時進行掃描，一路是激發光，用于成像，另一路是STED光通過相位調制產生甜甜圈形狀的光斑，用于抑制焦點邊緣信號，從而獲得更小的點擴散函數（圖5（a）），其分辨率可達30～80 nm，且可以實現三維成像。有研究者發現低溫下，cryo-STED的分辨率可以提升1.6倍[25]，然而文獻中的樣品是緩慢降溫，并未進入玻璃態，而且低溫下所需的功率密度可達MW/cm2～GW/cm2。此外，還有研究證明300 W/cm2強度激光照射樣品1～2分鐘，就會破壞玻璃態，導致冷凍樣品中產生冰晶。最近一些研究人員將STED成像應用于樹脂包埋后的生物樣品中，并與透射電鏡圖像進行關聯[8,26-27]，而在原位冷凍生物樣品中的應用還有待進一步研究。

圖5 幾種超分辨冷凍熒光顯微鏡示意圖。（a）冷凍STED成像；（b）冷凍單分子定位成像；（c）冷凍結構光照明成像；（d）冷凍Airyscan成像Fig. 5 Schematic diagrams of cryo supper resolution fluorescent microscopy. (a) cryo-STED; (b) cryo-SMLM; (c) cryo-SIM;(d) cryo-Airyscan

基于熒光分子的光轉換能力，研究人員提出了冷凍單分子定位成像（cryo-SMLM）。該技術使每次采集圖像僅有少量的單個熒光分子發光，并準確定位每個熒光分子的點擴展函數質心，再將多張圖像疊加形成一幅超高分辨率的圖像（圖5（b））。冷凍單分子定位成像包含冷凍光激活定位（cryo-PALM）、冷凍隨機光學重建（cryo-STORM）、冷凍熒光活化定位（cryo-fPALM），冷凍光學波動成像（cryo-SOFI）等，分辨率取決于探測到的單個熒光分子的光子數。目前已有多種單分子熒光定位成像應用于冷凍樣品中[28-32]。通過采用長工作距，較高數值孔徑（0.75～0.8）的空氣物鏡，提供了出色的分辨率（75～125 nm）。2021年，Andrian等人采用DNA-PAINT單分子成像技術和透射電鏡成像關聯，實現了對納米顆粒的高精度光電關聯[33]。然而,要達到常溫單分子定位成像的納米級別分辨率[34-35]，對于原位冷凍生物樣品來說，還面臨許多挑戰。首先，cryo-SMLM高度依賴于熒光分子在低溫下的轉換特性[36]，前期樣品制備較為復雜。針對這一問題，Robichaux等人在2019年將老鼠視網膜做成超薄切片，并進行cryo-STORM和cryo-ET成像，在感光細胞中發現了以前未知的亞結構，并揭示了關鍵蛋白的分布[37]；Moser等人于2019年采用cryo-SOFI成像對哺乳動物細胞進行成像，并與cryo-ET圖像進行關聯，由于SOFI的成像不需要光漂白或者光開關，所需的激發功率更低，能夠有效降低樣品結晶的風險[38]；Hoffman等人在2020年發表了有關原位冷凍多色單分子光電關聯成像的研究成果，他們采用液氦作為冷源，使用藍寶石蓋玻片支撐樣品，獲得了可以與透射電鏡精準關聯的高分辨光鏡圖像[29]。其次，長時間的高強度激光照射，導致樣品溫度升高，存在玻璃態被破壞的風險，針對這一問題，Liu等人采用方華膜載網代替炭膜載網，以降低載網從激光中吸收的熱量，這樣可以將用于單分子成像的光功率增加到1.75 kW/cm2，并獲得了75 nm的分辨率[32]?？墒?，由于方華膜對電子的吸收率較高，導致電鏡成像對比度和分辨率降低。此外，單分子成像的定位精度與收集到的光子數開方成正比，要實現超高分辨率，需要大量圖片疊加，耗時良久，單分子成像視場通常小于50 μm×50 μm，在光電關聯應用上，通常需要進行視場拼接，這進一步增加了成像時間。這也是限制冷凍單分子定位成像應用的主要因素。

冷凍結構光照明顯微成像（cryo-SIM）采用空間光調制器生成周期性條紋的激發光，并將3個不同方向的條紋光照射到樣品上，再利用算法重建出含有高頻信息的圖像，其橫向和軸向分辨率相比寬場成像可以提高2倍（圖5（c））。由于多數熒光蛋白低溫下的熒光強度更高，更不易漂白，基于此，cryo-SIM已經成功應用到冷凍樣品成像中[29]。然而，傳統的SIM成像對調制照明光路像質要求非常高，容易在圖像重建中出現偽像。對原位冷凍光鏡成像來說，顯微物鏡僅能使用長工作距的空氣物鏡，加上物鏡到樣品焦面真空和玻璃態水的折射率偏差，SIM系統的像質難以保證。Arnold等人將在光鏡和電鏡中均能成像的鐵磁小球鋪在生物樣品上，利用小球的相對位置對光鏡和電鏡圖像進行配準，將圖像關聯精度提高到200～300 nm[6]。Hoffman等人則首先在液氦溫度下，通過cryo-SIM得到光鏡圖像，再用冷凍樹脂替代樣品，送入FIB-SEM雙束電鏡中進行切片成像，最后利用樣品中的熒光小球進行光電關聯配準[29]。Phillips等人開發了一套3D cryo-SIM成像系統，采用NA為0.9，工作距離為2 mm的物鏡。對于488 nm激發光的熒光小球，成像橫向分辨率和軸向分辨率分別為210 nm和640 nm[39]。

冷凍Airyscan（cryo-Airyscan）顯微成像是一種基于像素重構原理（Pixel Reassignment）的超分辨成像技術，它源自生物光學成像的金標準——共聚焦顯微成像技術。cryo-Airyscan將原先的針孔替換為陣列探測器。陣列探測器的每個單元獨立成像。通過對每個單元圖像解卷積和移位線性運算，可以重建出最終的超分辨圖像，其分辨率相對于傳統共聚焦成像（未做解卷積）提高了1.7倍（圖5（d））。如果將每個探測單元的圖像不經過移位直接相加，就得到了共聚焦圖像。cryo-Airyscan成像與cryo-SIM成像類似，均可使冷凍樣品的熒光強度提高，光漂白效應減弱，并且已經成功應用到冷凍生物樣品中[40]。此外，由于Airyscan采用點掃描和有限尺度探測的成像方式，在圖像重建之前，就已經有效過濾了焦面外的背景熒光，更適用于熒光分子分布更密集的厚樣品。Zeiss公司開發了一套基于Airyscan的cryo-CLEM成像系統，并成功應用于FIB-SEM和Cryo-ET[10,41-42]。

國內方面，中國科學院生物物理研究所成像平臺開發了一套基于寬場成像的cryo-CLEM系統HOPE[43]，其硬件主體是一臺高真空冷臺。其可以搭載在寬場熒光顯微鏡上，實現冷凍熒光成像，并可與透射電鏡冷凍樣品桿連接。由于機械結構的限制，該冷臺只使用了10倍和40倍的空氣物鏡。此外，徐濤課題組還開發了一套基于單分子成像的冷凍超分辨sCLEM成像系統[20,44]。該系統采用開放式冷凍樣品臺，其收集端使用柱透鏡以提高軸向分辨率，并引入實時漂移校正（校正精度約5 nm）模塊。該系統可以使用NA為0.8，工作距離為3 mm的空氣鏡，橫向分辨率可達13 nm，軸向分辨率約為40 nm。

4.2.2 嵌入式冷凍光電關聯成像系統

嵌入式冷凍光電關聯成像流程如圖6（b）所示。首先在電鏡載網上培養細胞和熒光標記，再將載網放入冷凍設備中進行快速冷凍或高壓冷凍，然后通過冷凍傳輸將樣品傳到嵌入式光電關聯設備中進行光鏡成像、光電圖像關聯和FIB切割減薄，最后將樣品冷凍傳輸到冷凍透射電鏡中，進行Cryo-ET成像。對比分體式系統，嵌入式系統的流程中少了將樣品冷凍傳輸送入光鏡和FIB-SEM的過程，而是直接在電鏡艙室內完成冷凍光鏡成像、光電圖像關聯和FIB減薄。由于在冷凍傳輸過程中部分樣品存在升溫的可能，減少冷凍傳輸的步驟不僅可以簡化成像流程，提高效率，還能減少樣品污染的風險。另外，由于冷凍光鏡和電鏡成像位于同一腔室，可以方便快捷地在兩種成像模式中進行切換。FIB的減薄過程，也能夠用冷凍光鏡進行監控，從而提高減薄的準確率。同時，嵌入式冷凍光鏡由于部分嵌入雙束電鏡中，受限于電鏡腔室大小和外形尺寸，很難采用復雜的光路結構，現有的嵌入式冷凍光鏡大多采用比較簡單的成像模式。

圖6 嵌入式cryo-CLEM成像系統的（a）示意圖和（b）成像流程Fig. 6 (a) Schematic diagram and (b) block diagram of imaging process of integrated cryo-CLEM system

Faas等人最早將一個寬場顯微鏡集成到透射電鏡中，并應用于觀測冷凍樣品，命名為iLEM[45]。其可以通過熒光位置判斷樣品薄片上的感興趣區域。iLEM的主要限制因素是透射電鏡腔室內的空間有限，冷凍光鏡的分辨率很低，而且采用光電關聯成像的重要原因是這種結構無法實現熒光導航樣品減薄。后來，Gorelick等人提出將一個寬場光學顯微鏡集成到一臺商用雙束電鏡中。其可以使用若干不同的商用顯微物鏡，最高NA為0.95，工作距為0.33 mm，可實現對原位冷凍樣品的高分辨成像[5]，同時通過采用鐵磁小球進行光電圖像配準，指導FIB減薄。隨后，Delmic公司開發了一套嵌入式光電關聯成像系統——METEOR，該系統可以外掛在商用FIB-SEM電鏡艙室上，并通過真空法蘭將光路導入電鏡腔室內[46]，從而實現多色寬場熒光成像，并指導FIB減薄[47-48]。

5 總結與展望

自從Schwartz等人首次將冷凍熒光成像和冷凍電鏡成像相結合[49]，cryo-CLEM技術已經發展了15年，它結合了冷凍電鏡成像的高分辨能力和熒光成像的特異性標記能力，隨著細胞原位蛋白解析在生物學上的應用越來越廣泛，cryo-CLEM及其派生的熒光導航減薄技術有著廣闊的應用前景。然而，作為一項新興技術，cryo-CLEM還遠不夠成熟，有很多挑戰有待克服。

cryo-CLEM目前有兩條技術實現路線：分體式和嵌入式cryo-CLEM成像。分體式cryo-CLEM成像中的冷凍光鏡獨立于電鏡存在，其可以在現有的熒光顯微鏡上嵌入冷凍樣品臺，目前已經開發出多種成像模態。目前面臨的技術瓶頸主要是冷凍樣品臺的機械穩定性和溫度穩定性，尤其對于超分辨冷凍熒光成像，例如對于cryo-SMLM，冷凍樣品臺需要達到納米級別的穩定性，才能獲得納米量級的分辨率，才能更好地與cryo-ET圖像匹配[50]。此外，絕大多數冷凍熒光成像使用的都是空氣物鏡，數值孔徑有限，這影響了冷凍熒光成像的分辨率和信噪比。因此，研制能夠在冷凍條件下使用的浸沒式物鏡，進一步提高數值孔徑和光子接收效率，也是未來的發展方向。

除了硬件技術本身的限制，冷凍樣品本身也是限制冷凍超分辨熒光成像的因素。首先，cryo-SMLM和cryo-STED都需要很高的局部功率密度才能產生光漂白、光轉換或者光損耗效應，而過高的激光功率密度產生的熱效應會使得冷凍樣品發生局部結晶，從而破壞冷凍透射電鏡的成像效果。因此，cryo-SMLM和cryo-STED的激發功率密度遠低于室溫下的SMLM和STED成像，對于cryo-STED來說，較低的STED光功率限制了成像的分辨率，而對于cryo-SMLM來說，如果沒有光漂白或是光轉換效應，則無法進行單分子成像。在較高激光功率密度下，如何及時給冷凍樣品降溫，避免樣品局部結晶是一個可行的思路。其次，在低溫冷凍條件下，很多熒光探針的特性發生了改變，大多數探針的熒光效率更高，同時更難被漂白或發生光轉換效應，這對cryo-SIM和cryo-Airyscan這類成像來說是有利因素，而對cryo-SMLM來說則是不利因素，因此，探索單分子熒光探針的低溫特性，開發能夠在冷凍條件下使用的單分子探針也是未來的發展方向之一。

對于cryo-CLEM來說，將冷凍光鏡和電鏡模式下所成圖像進行精確配準，是成功實現原位光電關聯和熒光導航離子束減薄的必要步驟。光電關聯圖像配準通常分為兩步。第一步是粗略配準，通過使用帶有坐標標記的電鏡載網實現；第二步是精確配準，目前常用的方法是在生物樣品制備過程中，鋪設在熒光成像和電鏡下都能看到的鐵磁珠、金顆?；蚓郾揭蚁┬∏颍龠x取一些小球作為基準，將兩幅圖像進行配準。由于FIB圖像相對于SEM和熒光圖像有一個夾角，而且最終的樣品薄片小于200 nm，故要實現精準的FIB減薄，需要將熒光圖像和FIB圖像進行精確的三維配準。理論上來說，只要選取的配準點足夠多，就能夠實現高精度的三維配準，可是在實際使用中還存在很多問題。例如在分體式cryo-CLEM中，從冷凍熒光成像到冷凍電鏡成像，需要經過冷凍樣品轉移。轉移過程可能會改變樣品的局部形態，導致配準失敗。此外，在配準點中心的選擇、目標中心的選擇等人工過程中也存在誤差，這些都會對配準精度產生影響。針對上述問題，提高原位冷凍光電關聯圖像配準精度是未來的重要發展方向。

另一種cryo-CLEM成像技術路線—嵌入式cryo-CLEM成像，是將冷凍光鏡集成在FIBSEM電鏡腔室內，少了一個冷凍樣品傳輸步驟，故可以降低樣品結晶和污染的風險，且在FIB減薄過程中，可以方便地檢查熒光狀態，較分體式cryo-CLEM更有優勢。嵌入式cryo-CLEM還處于發展的初級階段，光鏡模態目前僅限于寬場成像，分辨率較低，且缺失三維信息，主要限制因素是電鏡腔室內空間有限，而光鏡的其他模塊如果外掛在電鏡主體上，可能影響電鏡的機械穩定性。因此，下一步需要做的工作包括：第一，擴展嵌入式cryo-CLEM中光鏡的成像模態，引入三維成像和超分辨成像，提高光鏡的成像分辨率；第二，使嵌入式cryo-CLEM為熒光導航FIB減薄提供更多信息，便于檢查樣品減薄過程中的熒光，為了提高熒光導航減薄的精度和準確性，需要發展新的光電關聯配準流程和方法。