仿生皮膚電化學傳感器的構建及其對雞蛋過敏原卵清蛋白的檢測

劉 兵，曹瀚文，蔣棟磊

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023）

在過去幾十年間，雖然食品安全的重視程度不斷提高，但食品安全事件卻依然層出不窮[1]。食物過敏是人體對食品中的抗原物質產生的、由免疫系統介導的不良反應，可分為4種類型：IgE介導的I型超敏反應、II型毒性超敏反應、III型免疫復合物超敏反應和T細胞介導的遲發性過敏反應[2]，其中IgE介導的食物過敏發病快，易觸發，是更常見的類型[3-4]。目前，食物過敏的發病率正逐年上升，且呈現出工業化地區人口的發病率高于其他地區、兒童發病率普遍高于成人的特點，約有8%的兒童和5%的成人對食物有過敏癥狀，部分地區食品過敏患者的比例已高達10%[5]。已被確定含有過敏原的食品高達170余種且因地理或個體因素而有差異，但就種類而言，日常生活中常見的食物過敏原主要有雞蛋、牛奶、花生、堅果、魚蝦、貝類、小麥和大豆8種[6]。對于與食物過敏緊密相關的公眾來說，難以避免攝入含有過敏原的食物[7]，并且目前暫無有效的、標準化的食品過敏疾病的根治手段，盡量避免食用過敏原仍然是保護過敏人群健康的唯一途徑[8]，這就突出了過敏原檢測技術的重要地位。

常規的過敏原檢測方法有：1）免疫學檢測技術，例如酶聯免疫吸附測定、蛋白質印跡分析等[9-10]。盡管基于免疫的檢測方法靈敏度和效率高，但需要高度純化和穩定的蛋白樣品，同時操作復雜、檢測時間長、重復性差等缺陷限制了其應用[11]，因此，該類方法并非快速檢測食物過敏原的最佳選擇。2）分析生物學檢測方法，例如聚合酶鏈式反應、環介導等溫擴增技術等[12-13]。此類方法檢測的目標物主要是特定的DNA片段，而非特定的致敏蛋白質。3）色譜檢測方法，例如高效液相色譜、液相色譜-串聯質譜等[14]。由于其高效、靈敏度高、選擇性好等優點，至今仍在傳統檢測方法中占據主要地位，但對實驗室的高要求（昂貴笨重的設備）限制了其在即時、現場檢測領域的應用。

作為一項多學科交叉的技術，電化學生物傳感技術因其具有響應時間快、高靈敏度、高選擇性等突出特點，已然成為食物過敏原檢測的研究前沿和熱點[15]。將生物元件固定在電極表面可以識別目標物體，并通過將生物元件的識別信號轉換成數字電信號觸發化學反應[16]，然后對檢測樣品進行定量或半定量分析。更為重要的是，電化學檢測技術能夠滿足現場化、簡便化、實時監測的需求，很好地彌補了傳統檢測方法的缺陷。根據固定在電極表面的生物識別分子的不同，電化學生物傳感器可分為免疫傳感器、核酸傳感器和細胞傳感器，其中細胞傳感器可以提供更全面、更復雜的信息（如凋亡、生長因子分泌、蛋白質合成等）。許多研究也表明可將肥大細胞作為識別元件，通過不同的固定方式固定在不同電極表面進行過敏原的檢測[17-20]。但如若能夠實現細胞在三維空間的排布，便可以更加真實地反應細胞形態和細胞間的相互作用，模擬過敏原進入人體后的真實反應，從而達到仿生的水平。生物3D打印技術為這一想法提供了合適的選擇。生物3D打印特指操縱活細胞打印活性三維結構的過程，即載細胞打印，也可稱為細胞打印[21]。將細胞作為原料混合水凝膠制備成生物墨水進行3D打印，不僅可以精確分配負載細胞的生物材料從而用于復雜三維功能活組織或人工器官的構建，還可以借助細胞這一有趣的生物識別元件打印組織結構，實現三維組織檢測和真實仿生傳感，從而拓寬仿生傳感器的應用范圍。

因此，本研究通過導電水凝膠包裹細胞配制成生物墨水，利用生物3D打印技術，旨在實現新一代仿生皮膚傳感器的開發，可用于雞蛋過敏原卵清蛋白的快速檢測。本實驗結果有望為食物過敏原的檢測和評價提供新思路，為進一步開發微組織傳感器提供新的策略和理論研究，為實現傳感檢測機理從細胞水平向組織層面的轉變提供一定指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

30%、60%、90%接枝率的甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA） 蘇州永沁泉智能設備公司；大鼠嗜堿性白血病（RBL-2H3）細胞、皮膚組織成纖維細胞 中國科學院細胞庫（中國上海）。

卵清蛋白、卵清蛋白標準品 美國Sigma-Aldrich公司；聚吡咯（polypyrrole，PPy） 南京先鋒納米科技有限公司；RPMI 1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素 美國Gibco實驗室；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS） 碧云天生物科技有限公司（中國上海）；實驗所用其他試劑均為分析級。

1.2 儀器與設備

PalmSens4電化學工作站 荷蘭PalmSens公司；EFL-8601光固化打印機 蘇州永沁泉智能設備公司；LSM 800共聚焦顯微鏡 德國Carl Zeiss公司；Pharos G2掃描電子顯微鏡 荷蘭飛納公司；SpectraMax M2e多功能酶標儀 美國分子儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 生物墨水的制備

用于構建仿生皮膚微組織的3D打印生物墨水采用導電水凝膠包裹細胞的形式進行制備。

GelMA導電水凝膠的配制：將1 g GelMA、25 mg光引發劑、5 mg光吸收劑、10 mL PBS，均放置于15 mL棕色離心管中；在50 ℃條件下水浴加熱30 min直至完全溶解。溶液經0.22 μm無菌微孔膜過濾到一個新的棕色小瓶中，得到水凝膠前驅液。將一定濃度PPy加入水凝膠前驅液中，超聲15 min，制備得到導電水凝膠。

最后將消化后的細胞懸浮液接種到上述GelMA導電水凝膠中制備成生物墨水。

1.3.2 生物墨水的表征及優化

1.3.2.1 流變測試

將凝膠前驅液放在流變儀的中心，選用直徑25 mm的壓板，板間距為1 mm，在掃描60 s時，固化光線照射。應變1%，角速率5 rad/s，輻照光源405 nm，30 mW/cm2，30 s；測試溫度（25±1）℃，時間300 s。

1.3.2.2 PPy濃度優化

對不同PPy摻雜量的水凝膠通過電化學手段差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）進行優化。DPV在以下條件下進行：初始電位-0.2 V；最終電位0.5 V；掃描速率30 mV/s；脈沖電位25 mV；脈沖時間0.10 s；脈搏周期500 ms。

1.3.2.3 打印參數的確定

打印參數如下：基層層數為80；印刷層高度為100 μm；光強為15 mW/cm2；基底曝光時間為15 s；層片曝光時間為12 s；z軸移動速率為20 mm/min；剝離距離為3 mm；剝皮速率為25 mm/min；脫皮恢復速率為200 mm/min；印刷料槽溫度為32 ℃。

1.3.3 三維多層皮膚組織模型構建

模擬人體皮膚組織的尺寸和結構，采用三維建模軟件3D Bulider設計體外多層皮膚組織模型。首先，皮膚模型由不同細胞在不同組織結構構成，致密的上層結構充當皮膚的表皮層，包含成纖維細胞。網格狀的雙層結構充當皮膚的皮下組織，包含肥大細胞。為了結合電化學傳感平臺，皮膚模型設計為可與工作電極區域面積相匹配的尺寸。模型的總尺寸為（7.48×4.84×1.8） mm3，表皮層高度為0.6 mm，皮下組織的高度為1.2 mm，孔徑440 μm。

1.3.4 生物3D打印制備皮膚模型

仿生皮膚模型的構建工作主要有以下3 個方面：仿生皮膚建模、打印材料合成、工藝參數優化。簡單來說，仿生皮膚結構通過基于DLP的3D打印機制造，特定設計程序遵循以下步驟，并以STL文件保存，打印是通過重復的過程，將圖像投射到水凝膠中，然后抬高z軸。打印過程：首先，2種類型生物墨水的細胞（RBL和皮膚組織成纖維細胞）在同一個細胞密度1×106cells/mL，分別均勻混合在生物墨水中。一旦上層完成，就會有一個停頓，使用另一個含有生物墨水的容器（RBL-2H3），在空間上排布打印槽內裝載的不同細胞以產生信號級聯，然后完成打印過程。

1.3.5 仿生皮膚電化學傳感系統的建立

將制備的含有細胞的生物墨水置于光固化3D打印機的打印槽中。導入建模文件并根據調試后的打印參數對皮膚模型進行切片和打印，打印工作時間為9 min，可同時打印數十個傳感元件。然后以生物打印皮膚組織為識別元件，采用柔性叉指電極作為傳感接口承載仿生皮膚模型，相比較于傳統絲網印刷電極，該柔性電極具有較大的工作電極區域且能與皮膚組織較好地匹配。在暴露的工作電極區域覆蓋仿生皮膚結構后，連接PalmSens4便攜式電化學工作站，基于皮膚模型的電化學傳感器已被制備。

1.3.6 電化學傳感系統的表征

接通PalmSens4電化學工作站，采用循環伏安法（cyclic voltammetry，CV）、DPV對仿生皮膚傳感的電化學行為測試。CV在以下條件進行：初始電位-0.3 V；最終電位0.6 V；掃描速率100 mV/s。DPV條件：初始電位-0.2 V；最終電位0.5 V；掃描速率100 mV/s；脈沖電位25 mV；脈沖時間0.10 s。

電化學測試均在室溫中進行，采用Ps trace模擬軟件進行分析，電解液為含有3.0 mmol/L鐵氰化鉀電解液。

1.3.7 雞蛋過敏原卵清蛋白的電化學檢測

首先將打印好的皮膚結構用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）沖洗3 次以去除未交聯的水凝膠。然后，精準放置皮膚結構于電極上，滴入卵清蛋白引誘RBL細胞脫粒（37 ℃孵育30 min）。在0.1～106Hz頻率范圍內，利用電化學阻抗法測定不同濃度卵清蛋白的阻抗圖譜。電化學檢測實驗均在室溫下進行。

1.3.8 電化學傳感器的特異性、重現性及穩定性實驗

為了評估該傳感器的特異性、重復性及穩定性，采用制備的傳感器檢測含有一些共存的物種，將傳感器對卵清蛋白的響應信號與其他共存物種的信號進行比較，以確定仿生皮膚微組織電化學傳感器的特異性。選取每組3 個、共5 組仿生界面，在37 ℃、RPMI 1640培養基條件下分別存儲0、3、6、9、12 h后檢測峰值電流。

1.4 數據處理

實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行統計分析和Origin 8.0進行作圖，每組實驗均設置3 次以上平行，數據表示為。差異顯著水平采用t檢驗，P＜0.05，差異顯著，P＜0.01，差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 傳感器的結構和工作原理

圖1 仿生皮膚電化學傳感器的構建過程Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of the bionic skin electrochemical sensor

引入生物3D打印技術可升級改造傳統的凝膠包裹細胞方法[22]。模擬食物過敏靶器官或組織，通過調整皮膚模型的尺寸和結構，利用生物3D打印技術制備仿生皮膚結構。在使用免疫細胞（肥大細胞）的基礎上，添加成纖維細胞，共同構建皮膚組織，從關注結構成形的“形似”，過渡到注重生物功能形成的“神似”。內因：肥大細胞與成纖維細胞的相互作用較重要，成纖維細胞可支持肥大細胞成熟表型；外因：單純細胞系模型雖然簡單易用，但單層分散的細胞缺乏細胞與細胞間、細胞與細胞基質間的相互作用，且在體外培養中容易丟失細胞的異質性和內在特征，從而無法真正反映機體內復雜的三維環境及重現組織功能[23]。如圖1所示，為了提高傳感器的靈敏度，在GelMA凝膠的基礎上，使用PPy制備導電水凝膠。導電生物墨水用于高通量打印皮膚模型結構，并將其固定在叉指工作電極區。皮膚結構用作識別元件識別卵清蛋白，使肥大細胞脫粒，然后利用電化學工作站將化學信號轉換為電信號（如電流、阻抗等）。

2.2 導電水凝膠的制備及其表征優化

2.2.1 GelMA水凝膠固化過程中的模量分析

圖2 30%、60%、90%接枝率的GelMA流變測試Fig. 2 Rheological test of GelMA with graft rates of 30%, 60% and 90%

為了成功構建仿生皮膚微組織，需要選擇合適接枝率的水凝膠用于3D打印，已有研究證實生物墨水的流變行為對打印性能起至關重要的作用[24]，特別是水凝膠的黏彈性，低黏度的水凝膠會導致凝膠前驅液擴散，從而降低形狀的保真度和力學性能[25]。此外，封裝在低黏度生物墨水中的細胞有快速沉積傾向，在印刷材料中無法做到均勻分布。也就是說，凝膠的剛度和彈性已被證明對3D仿生組織中的細胞行為有深遠影響，而正確地調整這些力學性能對培養的成功至關重要[26]。選用10 g/100 mL不同接枝率（30%、60%、90%）的GelMA，進行凝膠固化分析。如圖2所示，剛開始，前驅液的損耗模量（G’’）遠大于儲能模量（G’）時，材料主要發生黏性形變，呈液態。在1 min后開啟405 nm光源照射后，儲能模量逐漸增大，官能團單體聚合，開始交聯，黏度突增。在90 s時儲能模量和損耗模量趨于穩定，且儲能模量均高于損耗模量，流體表現為固體。考慮到后續皮膚模型的構建，在外界光照條件下可以更好地實現凝膠化，有利于微組織的成形，篩選60%、90%接枝率的GelMA水凝膠進行下一步的優化及后續的實驗。

2.2.2 GelMA水凝膠的電化學性能分析及PPy濃度優化

圖3 不同接枝率GelMA的電化學性能表征Fig. 3 Electrochemical properties of GelMA with different grafting rates

水凝膠的電化學性能對傳感器的檢測性能尤為重要，因此利用穩定的三電極電化學系統對不同接枝率的GelMA進行電化學性能分析。如圖3A、B所示，不同接枝率的GelMA均表現了微弱的氧化還原峰，且從DPV圖看，凝膠具有可忽略的導電能力，導電性GelMA 30＞GelMA 60＞GelMA 90，GelMA 60相比較于GelMA 90，導電性能有了明顯的增加。因此，結合2.2.1節水凝膠的固化模量，在保證微組織成形的基礎上同時兼顧傳感器電化學檢測的靈敏性，最終選取60%接枝率的GelMA 用于后續導電水凝膠的制備。

為了提高傳感器的靈敏度，需要在60%接枝率的GelMA中添加導電材料以增強其導電性，但導電材料的添加濃度嚴重影響著電化學傳感器的分析性能。為確定PPy材料的最佳添加量，采用電化學方法（DPV）進行優化。如圖3C所示，PPy質量濃度在2.0～3.5 mg/mL，電流峰值從7.87 μA增加到21.18 μA，表明PPy具有顯著的電信號放大功能，摻雜較高質量濃度的PPy能有效提高生物墨水的導電性，工作電極表面的活性位點數量增加，加速了電子轉移。但3.5 mg/mL的PPy/GelMA會在一定程度上干擾皮膚模型的打印，會造成同批次之間樣品的形狀形成較大的殘次。因此，確定PPy質量濃度3.0 mg/mL適用于之后的生物墨水制備工作。

2.2.3 PPy/GelMA導電凝膠及生物墨水的微觀形態

圖4 GelMA、PPy、GelMA/PPy和生物墨水電鏡圖Fig. 4 SEM images of GelMA hydrogel, polypyrrole,GelMA/PPy, and bio-ink

采用掃描電鏡、冷凍電鏡分別對單純GelMA、PPy和兩者復合物的微觀結構進行表征。圖4A顯示了GelMA凝膠的微觀表觀形態，大小不一的孔洞狀結構共同組成凝膠形態，且凝膠孔徑內表面較為光滑。圖4B顯示，由于微納米孔的存在使水凝膠具備三維多孔網絡結構，有利于與外界的氣質交換和保持溶液的進出通道，且這些孔增加了凝膠的表面積并允許其捕獲更多的水，使材料對所施加的電荷快速反應。由圖4C所示，PPy的大小約為600 nm，由此制備的導電水凝膠提供了良好的物理組合，有助于皮膚模型的構建。圖4D顯示了摻雜PPy的GelMA，GelMA/PPy內表面被PPy成功覆蓋，表面呈現出PPy所具有的粗糙狀態，這可能是因為形成的GelMA/PPy比GelMA具有更高機械強度，PPy形成互穿網絡嵌入水凝膠中而提高導電能力[27]。

圖4E可以看到，這種獨特的多孔網絡結構使水凝膠柔軟而濕潤，并且水凝膠內部的大量水可以為細胞提供生物相容且適宜的環境[28]。如圖4F所示，由于使用的GelMA分子含有利于細胞黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，可以看到細胞被黏附在明膠材料上，有助于細胞在培養中保持較好的功能性。有序的孔隙結構保證了內部的營養物質傳輸及細胞代謝廢物的排除。

2.3 生物3D打印仿生皮膚結構及其表征

圖5 皮膚模型建模圖和生物3D打印實際產品及其液體交換能力測試Fig. 5 Modeling diagram of the skin model, 3D bioprinted products and liquid exchange capacity test

圖5A顯示，該仿生皮膚結構可分為2 個部分，致密的上層結構（600 μm）可充當皮膚的表皮層，有利于保護傷口免受外界的機械沖擊和壓力。相比之下，下層的皮下組織（1.2 mm）設計成懸臂梁結構，管狀的網絡的真皮結構在液面下培養時促進營養物質的輸送和代謝產物排出，從而促進新生血管形成[29-30]。在顯微鏡下進一步觀察微通道為440 μm的微觀結構，確認與設計一致。

為了進一步確認下層的互聯結構，使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了懸臂梁結構，如圖5B所示，三維懸臂梁結構以高保真度清晰可見。將打印完成的皮膚組織用培養基輕輕沖洗3 遍后加入含有10% 胎牛血清的DMEM培養基浸沒培養30 min后，皮膚組織變成紅色，說明該組織具有優異的液體交換能力（圖5C）。

2.4 仿生皮膚傳感器的電化學表征

圖6 傳感器的電化學表征Fig. 6 Electrochemical characterization of the sensor

采用CV和DPV對仿生皮膚傳感器的不同修飾步驟進行電化學表征，如圖6所示，CV圖中插圖顯示了在裸叉指電極表面上的典型和可逆的氧化還原峰。當工作電極上放置純GelMA打印的皮膚結構時，氧化還原峰值變小，這說明此結構對電化學過程形成了屏障，阻止氧化還原探針進入電極表面。隨著PPy的添加，氧化還原峰值有一定程度的恢復，顯示出導電水凝膠具備一定的導電性。當測量仿生皮膚組織的電信號時，可以看到峰值電流明顯下降，細胞的添加影響皮膚本身的電阻，該結果可能是由細胞黏附引起，進而阻礙電子傳遞，導致電子傳輸速率變低，增加了電極的電阻。類似的信號變化如圖6B所示，沒有添加導電的材料的峰值電流為5.61 μA，在添加了PPy納米復合材料之后，峰值明顯增加，為19.40 μA，這表明填加了PPy納米材料可以顯著提高該皮膚組織的導電性能，有利于提高靈敏度。當添加細胞后，峰值電流降低，Ip值大約為14.94 μA。當細胞固定在以GelMA為主，添加了PPy納米材料的生物墨水打印的仿生皮膚時，可以為此提供生物相容、三維微納米環境，電化學表征結果表明，該皮膚模型具備優異的電化學響應。

2.5 仿生皮膚電化學傳感器對卵清蛋白的檢測

如圖7A所示，隨著卵清蛋白質量濃度的上升（0.5～2.5 μg/mL），工作電極表面的阻抗值（Ret）迅速增加，Nyqusit曲線半圓的直徑增大，這說明較低質量濃度卵清蛋白刺激細胞發生脫顆粒，釋放胞內各種介質如組胺、類胰蛋白酶和β-己糖胺酶等，這些因子會阻礙電子轉移，從而導致Ret增加。圖7B顯示了通過實驗獲得的卵清蛋白的標準曲線。可以看到電化學阻抗Ret對卵清蛋白的質量濃度良好響應，線性范圍為0.5～2.5 μg/mL，線性方程為y=4.45C+14.24，相關系數為0.998，根據公式檢出限=3s/k計算出檢出限為0.19 μg/mL，其中s表示空白樣品標準偏差（k=3），k表示卵清蛋白的標準曲線的斜率。以上實驗結果證明在一定的質量濃度范圍內，所構建的電化學細胞傳感器能夠準確靈敏地檢測卵清蛋白質量濃度。

圖7 不同質量濃度卵清蛋白的電化學檢測Fig. 7 Electrochemical detection of different concentrations of ovalbumin

2.6 仿生皮膚傳感器的特異性、重復性及穩定性

表1 1.0 μg/mL卵清蛋白分別在1.0 μg/mL干擾物下對傳感器的相對響應Table 1 Response of the sensor to 1.0 μg/mL ovalbumin in the presence of interferences (1.0 μg/mL)

特異性是構建傳感器的關鍵指標。以花生過敏原Ara h 1、醇溶蛋白、大豆球蛋白、蝦原肌球蛋白和牛血清白蛋白為干擾物，分別比較電化學傳感器的響應來評價細胞傳感器的特異性。如表1所示，相同濃度物種的阻抗比（Ret樣品/Ret對照）無明顯變化，說明本研究所構建的電化學細胞傳感器具有良好的特異性。

圖8 電化學傳感器的穩定性及重復性Fig. 8 Stability and repeatability of the electrochemical sensor

穩定性和重復性是評價細胞傳感器性能的重要指標。但細胞保存的條件較為苛刻，難以在外部環境長期保持良好的細胞活性，這對細胞傳感器的穩定性是一個挑戰。而利用生物3D打印技術可以達到仿生微組織的快速、規模化生產，在檢測前短時間內即可實現仿生微組織傳感器的構建，從而達到快速、現場檢測的要求，這就縮短了細胞傳感器需要保存的時間，降低了對貨架期的要求。因此，選取5 組仿生界面貯存在37 ℃、RPMI 1640培養基條件下，時間間隔為3 h檢測峰值電流。如圖8所示，峰值電流在18.8～19.2 μA范圍內（低于5%），說明該傳感器具有良好的重復性和穩定性。

3 結 論

利用生物3D打印技術進行含有表皮層和皮下組織的仿生皮膚結構的制備，成功開發一種仿生皮膚傳感界面，并將其應用于電化學傳感器的構建。使用3D Builder軟件對仿生皮膚結構進行三維建模，致密上層結構充當表皮層，管狀的網格結構充當皮下組織。模型的總尺寸為（7.48×4.84×1.8）mm3，表皮層高度為0.6 mm，皮下組織的高度為1.2 mm，孔徑440 μm。同時選取3.0 mg/mL PPy修飾GelMA以提高仿生皮膚導電性，結合叉指電極組建傳感器對雞蛋卵清蛋白進行電化學分析。檢測結果表明，在卵清蛋白質量濃度在0.5～2.5 μg/mL范圍內，Ret與蛋白質量濃度呈良好的線性關系，驗證了該仿生皮膚傳感器檢測卵清蛋白的可行性。使用3D生物打印技術可以縮短細胞傳感器的構建時間，降低制備成本，可滿足樣品現場快速檢測的需求。