人工采摘和管理對普洱生茶化學成分的影響分析

瞿巖儼，楊子嘉，李 軍，李 溱,*

（1.中國農業大學生物學院，北京 100193；2.中國農業大學網絡技術中心，北京 100083）

普洱茶產自云南西南部，以云南特有的大葉種茶青鮮葉經過萎凋、殺青、揉捻、曬干制成曬青毛茶，即普洱生茶[1]。普洱生茶經過渥堆發酵后得到普洱熟茶[2]。云南大葉種茶樹是喬木，與常見的灌木型小葉種茶樹在外形上有顯著差異[3]。云南現存大量樹齡超過一百年、甚至五百年的大葉種古茶樹。由于歷史和自然條件等原因。一些古樹茶園在生產過程中被荒廢，在一定時期內處于無人管理的荒廢狀態。荒廢茶園在恢復采摘和人工管理后，初期采摘茶葉的品質往往不佳，有較強的苦澀味并缺乏香氣。在經過3～5 a的采摘和人工管理后，茶葉苦澀味逐步褪去，香氣逐步提升，品質逐步恢復。本研究于2018年在云南省臨滄市雙江縣勐庫鎮祭天山一個已經被荒廢超過60 a的古樹茶園采集了處于自然野生狀態的茶青，制作成普洱生茶，又分別于2020年和2021年再次在該茶園收集經過采摘和人工管理2～3 a后的茶青，制成普洱生茶。經過對比品飲發現，2018年初次采摘的普洱生茶味道苦澀，沒有普洱茶特征性的清香和花果香，氣味如同腐爛的木頭。而2020年采摘的茶葉帶有普洱茶特有的清香，且入口苦澀味也有所減弱。2021年采摘的普洱茶，則香氣清純持久、滋味濃厚回甘。

本研究使用基于高分辨質譜的代謝組學技術，對野生普洱茶和經過人工采摘和管理的普洱茶的內含物質進行分析，解析普洱茶口味和品質變化與其內含物質之間的關聯關系。對普洱茶的無機離子、氨基酸、可溶性糖、黃酮、多酚、抗氧化能力進行分析，結合細胞實驗研究野生普洱茶和經過人工管理的普洱茶細胞毒性和抗氧化能力差異，旨在為解析野生大葉種茶樹在人工管理下的演化機制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱古樹生茶樣品由云南國色端莊茶葉有限公司提供，分別于2018、2020、2021年3月底至4月初采摘于云南省臨滄市雙江縣勐庫鎮祭天山。茶葉嫩度為一芽兩葉和一芽三葉，并在當年按照GB/T 22111—2008《地理標志產品 普洱茶》以相同的加工工藝制作成普洱生茶餅，茶餅在室溫條件下在昆明倉庫密閉貯藏。2018年是該茶園荒廢超過60 a后的首次人工采摘。

氨基酸、咖啡因標準品 美國Sigma公司；AccQ·Tag氨基酸衍生劑 美國Waters公司；超純水、乙腈（均為色譜級） 美國Thermo Fisher Scientific公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜級） 北京迪科馬科技有限公司；用于檢測細胞增殖及毒性的試劑盒（Biorigin/BN15201）、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（Biorigin/BN16033） 北京百瑞極生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

I-Class超高效液相色譜儀 美國Waters公司；Q-Exactive Focus高分辨質譜儀、ICS-5000離子色譜儀美國賽默飛世爾科技公司；R-5418離心機、Thermomixer振蕩儀 德國Eppendorf公司；KC-10S超聲儀 中國寧波碩力公司；BSA2202S天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

茶葉樣品使用研缽研磨成粉末，準確稱取0.02 g茶葉粉末放入離心管中，加入1 mL去離子水，室溫超聲提取30 min，14 000 r/min離心10 min，取上清過0.1 μm濾膜，進行后續的無機離子、可溶性糖、氨基酸含量分析和代謝組學分析等。

1.3.2 無機離子、可溶性糖含量分析

將茶葉提取液稀釋后進行離子色譜分析，每種樣品3 個重復。陽離子使用20 mmol/L的甲磺酸流動相，Dionex CS12A陽離子交換柱（4 mm×250 mm）和電導檢測器進行檢測[4]。可溶性糖使用Dionex PA10色譜柱（4 mm×250 mm），流動相為純水和200 mmol/L NaOH溶液的梯度洗脫程序，使用電化學檢測器進行檢測[5]。

1.3.3 游離氨基酸含量檢測

取10 μL茶葉提取液，加入50 μL硼酸鹽緩沖液和20 μL氨基酸衍生劑，室溫放置1 min，55 ℃振蕩器加熱振蕩10 min，冷卻至室溫后進行質譜分析，每種樣品3 個重復。使用Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相A為20 mmol/L乙酸銨（pH 5.0），流動相B為乙腈溶液（乙腈-水，80∶20，V/V），洗脫程序：0 min，97% A，3% B；2 min，97%～88% A，3%～12% B；9.5 min，88%～66% A，12%～34% B；10～12 min，66%～0% A，34%～100% B；12.5～15.5 min，0%～97% A，100%～3% B。流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；樣品室溫度15 ℃；進樣量1 μL。使用Q-Exactive Focus高分辨質譜儀檢測色譜洗脫物的一級和二級質譜，正離子模式；毛細管溫度320 ℃；噴霧電壓3.5 kV；輔助氣溫度350 ℃；霧化氣，輔助氣和反吹氣流速分別為35、10、5 個單位；質量掃描范圍m/z70～1 000[6]。

1.3.4 代謝組學分析

1.3.4.1 樣品處理及分析條件

將茶葉提取液稀釋后進行基于高分辨質譜的代謝組學分析，每種樣品6 個重復，將茶葉提取物等量混合得到質控樣品。使用Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A為水（含有0.1%甲酸），流動相B為乙腈（含有0.1%甲酸）；洗脫程序：0 min，95% A，5% B；5 min，95%～70% A，5%～30% B；10 min，70%～5% A，30%～95% B；13 min，5% A，95% B；13.1 min，5%～95% A，95%～5% B；16 min，95% A，5% B。流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；樣品室溫度8 ℃；進樣量5 μL[6]。質譜條件同氨基酸分析。

1.3.4.2 茶葉內含物質含量測定

向200 μL茶葉提取物中加入2.5 mL 0.1 mol/L福林-酚試劑，混勻后靜置5 min，加入2 mL 7.5% Na2CO3溶液和5 mL水，室溫避光放置1 h，檢測反應后溶液在波長765 nm處的吸光度，以沒食子酸作為標準品測定茶葉中總酚含量。

向50 μL茶葉提取液中加入3 mL鐵離子還原/抗氧化能力試劑和6 mL水，37 ℃放置20 min，檢測反應后溶液在波長590 nm處的吸光度，以抗壞血酸作為標準品測定茶葉的抗氧化能力[7]。

1.3.5 細胞實驗

對照組培養基：未加茶葉提取物的DMEM培養基。實驗組培養基：每1 mL DMEM培養基加入20 μL茶葉提取物的培養基，每種茶葉做5 個重復。U2OS細胞系由中國農業大學生物學院傅靜雁教授課題組提供。

CCK-8細胞增殖實驗：取4 000 個U2OS細胞懸液鋪板（96 孔板），貼壁后使用實驗組和對照組培養基在37 ℃，5%二氧化碳的細胞培養箱中培養8 h，棄掉培養基，用新鮮培養基清洗后，加入100 μL培養基和10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育3 h。用酶標儀檢測波長450 nm處吸光度[8-9]。

DCFH-DA測定ROS：用無血清培養基將DCFH-DA探針稀釋1 000 倍作為工作液（8 μL母液+8 mL培養基）。取密度為1.5×105/mL的細胞懸液鋪板（35 mm培養皿），貼壁后利用實驗組和對照組培養基培養8 h（培養條件同上）。之后棄掉培養基，用無血清培養基清洗兩次，加入1 mL DCFH-DA探針工作液。37 ℃孵育30 min，進行熒光檢測。激發波長500 nm，發射波長525 nm[10]。

1.4 數據統計及圖表繪制

無機離子、可溶性糖含量分析的離子色譜數據使用Chromeleon7.2 SR5軟件進行峰面積積分和定量分析。在游離氨基酸含量檢測中，質譜數據使用Xcalibur軟件進行峰提取，根據標準品的峰面積計算樣品中游離氨基酸的含量。在代謝組學分析中，質譜采集的原始數據導入Progenesis QI軟件（美國Waters公司）進行色譜保留時間對齊、質譜峰匹配與峰面積提取，單因素方差分析（ANOVA），并篩選具有組間顯著性差異的化合物。QI軟件提取的質譜特征峰列表導入SIMCA-P 13.0軟件（瑞典Umetrics公司）中，進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析。篩選得到的差異化合物使用二級質譜結合HMDB和茶葉代謝物數據庫進行鑒定。柱狀圖繪制利用GraphPad Prism（GraphPad Software）和Origin軟件（OriginLab），熱圖分析使用Origin軟件。顯著性分析利用SPSS軟件（美國SPSS股份有限公司）進行單因素方差分析（ANOVA）中的Duncan分析。

2 結果與分析

2.1 無機離子含量

圖1 不同采摘年份普洱生茶中K+含量Fig. 1 Contents of K+ in raw Pu-erh tea picked in different years

K+可以維持適當的跨膜電位，調節細胞膨壓，還作為酶的輔基參與代謝調節[11]。植物在缺K+時，抗旱、抗寒能力下降，葉片失水，老葉邊緣焦枯[12]。2020年和2021年茶葉中K+含量存在顯著差異（圖1），但不同年份采摘的茶葉中K+含量均為10 mg/g左右，2020年與2021年茶葉的K+含量僅相差8.7%，說明人工管理對茶葉中K+含量的影響較小，茶樹生長環境較穩定。

2.2 可溶性糖含量

圖2 不同采摘年份普洱生茶中葡萄糖、蔗糖含量Fig. 2 Contents of glucose and sucrose in raw Pu-erh tea picked in different years

普洱茶中檢測到主要的可溶性糖為葡萄糖和蔗糖，其中蔗糖含量略高于葡萄糖（圖2）。2018年和2020年茶葉的葡萄糖含量具有顯著差異，但變化倍數較小，僅為1.093 倍，而2020年采摘茶葉的蔗糖含量明顯高于其他2 個年份，說明人工管理過程會顯著影響茶葉的可溶性糖含量。蔗糖可以降低多酚類物質的澀味強度及持續時間，這可能是2020年茶滋味改善的原因之一[13]。

2.3 代謝組學分析

2.3.1 PCA結果

圖3 不同采摘年份的普洱生茶差異代謝物PCA得分圖Fig. 3 Principal component analysis score plot of differential metabolites in raw Pu-erh tea picked in different years

表1 不同采摘年份的普洱生茶差異化合物信息Table 1 Information about the differential compounds in raw Pu-erh tea picked in different years

續表1

對3 個年份采摘的普洱茶進行高分辨質譜分析，共檢測到5 322 個特征質譜峰，其中滿足P≤0.05，變異系數≤20%，變化倍數≥1.5的特征峰有1 104 個，對這1 104 個質譜峰進行PCA，質控樣品很好地聚集在PCA得分圖的中間，不同年份采摘的茶可以明顯分開，且隨采摘年份呈現規律性的分布，顯示人工干預對普洱茶內含物質的組成與含量產生顯著影響（圖3）。

2.3.2 差異代謝物鑒定

從5 322 個特征質譜峰中篩選了P≤0.05，變異系數≤20%，變化倍數≥1.5，變量投影重要性大于0.94，質譜峰面積大于7 400的400 個峰進行二級質譜鑒定，共鑒定到69 個差異代謝物。其中包括黃酮及其衍生物類物質18 個，兒茶素類/多酚類物質16 個，生物堿類物質11 個，其他代謝物5 個（表1）。對鑒定到差異代謝物進行熱圖分析（圖4），發現大部分兒茶素類物質在2021年茶葉中含量較高；部分兒茶素類、部分黃酮及其衍生物類在2020年茶葉中含量較高，而大多數黃酮及其衍生物類物質在2018年茶葉中含量較高，說明采摘和人工管理對茶葉中兒茶素及黃酮及其衍生物等內含物質的組成與含量產生了較大影響。

總的來看，2021年茶中兒茶素類化合物含量較高，是2021年茶湯入口回甘的主要原因。而2018年茶中黃酮及其衍生物含量較高，是2018年茶湯苦澀的原因之一。2020年茶葉則體現了2018年向2021年的轉化過程，茶葉中兒茶素類物質逐漸增加，黃酮及其衍生物逐漸減少。表明采摘和人工管理可以顯著改變茶葉的化學組成，進而改善其口感與品質。

圖4 不同采摘年份普洱生茶差異代謝物熱圖Fig. 4 Heatmap of differential metabolites in raw Pu-erh tea picked in different years

2.3.3 兒茶素/多酚類化合物

兒茶素類化合物是茶葉中最主要的多酚，約占茶葉中茶多酚含量的60%～80%[14]，具有卓越的清除ROS、抑制腫瘤細胞增殖能力[15-16]。兒茶素類化合物呈味苦澀回甘，是茶葉中重要的呈味物質[17]。Robichaud等[18]的研究認為兒茶素類化合物的苦味強于澀味。采摘于2018年茶葉中(-)-表沒食子兒茶素3-對-香豆酸酯和鞣花酸含量較高。而2020年采摘的茶葉中7-沒食子酰兒茶素、1,4-二-O-咖啡酰奎尼酸、(+)-沒食子兒茶素、表沒食子酰兒茶素、聚酯型兒茶素C等含量較高。2021年采摘的茶葉中沒食子酸及沒食子酸酯、3’-沒食子酰原翠雀素B2、異茶黃素、3-O-沒食子酰金縷梅單寧、茶黃酸、異茶黃素3’-沒食子酸酯等含量較高（圖4）。化學分析顯示3 個年份茶葉中總多酚含量沒有顯著差異（圖5），說明采摘和人工管理會對茶葉中總多酚含量影響較小，但會顯著改變茶葉中兒茶素類化合物組成和相對含量。

圖5 不同采摘年份普洱生茶多酚含量分析Fig. 5 Contents of polyphenols in raw Pu-erh tea picked in different years

2.3.4 黃酮類化合物

黃酮類化合物是茶葉中重要的呈味和活性物質，其呈味苦澀，可以增強咖啡因的苦味[19]，同時具有清除氧由基等抗氧化作用[20]。黃酮類化合物可以通過腸道微生物群發揮其抗氧化、降血脂、調血糖、抑炎癥等生理功效，預防二型糖尿病、阿茲海默癥等多種疾病[21]。在本實驗鑒定到屬于黃酮及其衍生物類物質的差異代謝物中，花旗松素3-阿拉伯糖苷、芹菜苷、花青素7-葡萄糖苷等黃酮類化合物在2021年茶葉中含量最高，而飛燕草素3-(3’-p-香豆酰葡糖苷)、槲皮素3-(3-p-香豆酰葡糖苷)等在2020年采摘的茶葉中含量較高，而其余的大部分黃酮及其衍生物類化合物均在2018年含量較高（圖4）。

2.3.5 生物堿類化合物

圖6 不同采摘年份普洱生茶中咖啡因含量Fig. 6 Contents of caffeine in raw Pu-erh tea picked in different years

咖啡因、可可堿、次黃嘌呤均為次黃嘌呤類生物堿，它們是茶葉苦味的主要來源[22]。通常認為咖啡因可以與兒茶素類化合物相互作用，增強兒茶素類化合物的回甘與苦味，但是對兒茶素類化合物的澀味影響不大[17]。可可堿則可作為支氣管舒張劑和血管舒張劑[23]。對咖啡因的質譜信號進行分析發現，不同年份采摘的茶葉中咖啡因含量相差不大（圖6）。可可堿在2021年采摘茶葉中含量最高，在2020年與2018年采摘茶葉中含量相差不大，而次黃嘌呤在2018年茶中含量最高（圖4）。咖啡因約占茶葉干質量的1%～5%，不同年份采摘茶葉中咖啡因含量保持穩定說明人工干預沒有對茶樹生長產生顯著影響。除了次黃嘌呤類生物堿，游離核苷酸也是重要的呈味物質。在2021年茶中含量較高的脫氧肌苷單磷酸是一種5’-單磷酸核苷酸（圖4），被認為會加強鮮味的味覺[24]。

2.3.6 氨基酸含量分析

圖7 不同采摘年份普洱生茶總氨基酸及茶氨酸含量Fig. 7 Contents of total amino acids and theanine in raw Pu-erh tea picked in different years

氨基酸是茶葉中重要的呈味物質。對比3 個年份采摘茶葉的總氨基酸含量（圖7），采摘于2018年茶中總氨基酸含量最低，為49.53 μmol/g（8.03 mg/g）；2021年最高，為63.31 μmol/g（10.00 mg/g）；2020年為57.85 μmol/g（9.20 mg/g）。

茶葉中含量最高的氨基酸是茶氨酸，是茶葉鮮爽味的主要來源[25]，茶氨酸還可以減緩心理和生理應激反應，舒緩情緒[26]。2021年采摘的茶葉中茶氨酸含量達到25.10 mol/g，對應茶葉的鮮爽味也最強（圖7），說明采摘和人工管理會顯著改善茶葉中茶氨酸的含量，提高茶葉品質。連續人工管理和采摘4 a（2021年）茶葉中的丙氨酸（2.44 μmol/g）和谷氨酰胺（3.49 μmol/g）含量也都顯著高于長期未采摘的茶葉（2018年，0.99 μmol/g和1.23 μmol/g），丙氨酸和谷氨酰胺都呈鮮味，表明人工管理可以顯著提高茶葉的鮮爽度[27]（圖8）。

圖8 不同采摘年份普洱生茶氨基酸含量變化熱圖Fig. 8 Heatmap of amino acid contents in raw Pu-erh tea picked in different years

采摘于2021年茶中的賴氨酸含量明顯低于其他年份。2018、2020和2021年茶中賴氨酸含量分別為1.18、0.64 μmol/g和0.68 μmol/g，賴氨酸呈苦味[28-29]，其含量隨采摘時間增加而下降說明人工管理可以有效改善茶葉的苦澀（圖8）。

茶葉中精氨酸的含量在人工管理后迅速上升，2018年茶葉中精氨酸含量為0.70 μmol/g，到了2020年，精氨酸含量迅速提高到3.99 μmol/g，到2021年仍維持3.27 μmol/g的高含量。精氨酸呈苦味回甘[30]，被認為具有增香作用[31]，其含量在人工采摘后迅速上升，表明人工管理可以顯著提高茶葉的香氣，同時可以加強茶葉的回甘（圖8）。

對不同年份采摘茶葉的氨基酸含量進行聚類分析（圖8），結果分成3 類，第1類在長期未采摘的茶葉（2018年）中含量最高，主要是呈苦味的氨基酸，如苯丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和組氨酸等[32]；第2類在2020年茶葉中含量最高，包括呈鮮味的天冬氨酸和有增香作用的精氨酸；第3類在2021年茶葉中含量最高，主要是呈鮮味的氨基酸，如茶氨酸、谷氨酸，以及呈甜味的氨基酸，如蘇氨酸和丙氨酸[6]。另外，具有鎮靜、抗壓等生理活性的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）也是在2021年茶中含量最高[33]。

從氨基酸定量分析和聚類分析結果看，長期未采摘茶葉的氨基酸總含量低，且呈苦味的氨基酸含量高。開始每年的正常采摘之后，茶葉中氨基酸總含量增加，呈苦味的氨基酸含量降低，呈甜味和鮮味的氨基酸含量增加，且GABA含量也隨之增加，茶葉的品質隨采摘時間的延長逐漸提高。

2.3.7 細胞增殖實驗和ROS測定實驗

圖9 細胞增殖實驗和ROS測定實驗Fig. 9 Inhibitory effect of raw Pu-erh tea picked in different years on tumor cell proliferation and ROS scavenging effect

研究表明綠茶提取液可以抑制骨肉瘤癌細胞的遷移[34]，本實驗使用U2OS細胞（骨肉瘤細胞）表征茶湯的細胞毒性和抗氧化能力。CCK-8細胞增殖實驗表明，茶湯可以顯著抑制U2OS細胞的增殖。其中2021年采摘茶葉的茶湯對U2OS細胞增殖的抑制最明顯，2018年次之，2020年茶葉的茶湯對U2OS細胞增殖的抑制最弱（圖9）。

圖10 不同采摘年份的普洱生茶抗氧化能力分析Fig. 10 Antioxidant capacity of raw Pu-erh tea picked in different years

茶葉中的多酚與黃酮均有抗氧化的作用。化學分析結果顯示，不同年份采摘茶葉在細胞外的抗氧化能力沒有顯著差異（圖10）。但DCFH-DA細胞ROS自由基分析顯示采摘于2021年茶葉對U2OS細胞內ROS的清除能力最強，2018年茶湯次之，2020年茶湯對U2OS細胞內ROS清除能力最弱（圖9）。

細胞增殖實驗和ROS測定實驗結果顯示，采摘于2021年茶葉對U2OS細胞增殖的抑制作用最強，對ROS的清除能力也最強。即2021年采摘的茶葉在抗癌、抗氧化方面的功效更好。

3 結 論

本實驗使用離子色譜、高效液相色譜-高分辨率質譜聯用、化學分析和細胞活性實驗等方法，解析了經過多年荒廢后的云南大葉種茶樹在恢復采摘和人工管理后內含物質的變化規律，及其與普洱茶品質、口味和保健功效的關聯關系。研究結果表明茶葉無機離子、咖啡因、總多酚含量較為穩定，說明茶樹生長較為穩定。化學分析結果顯示3 個年份采摘茶葉的抗氧化能力無顯著差異，但細胞增殖實驗和ROS測定實驗結果顯示2021年采摘茶葉對U2OS細胞內ROS的清除作用最強，對U2OS腫瘤細胞增殖的抑制作用也最強。氨基酸定量分析結果顯示，經過多年荒廢后的茶葉中氨基酸總含量低，且呈苦味的氨基酸含量高，而經過多年人工采摘后（2021年），茶葉氨基酸總含量以及呈鮮味和甜味的氨基酸含量均顯著高于其他兩個年份的茶葉。

代謝組學分析發現可以用于區分不同采摘年份茶葉的69 個化合物。其中呈味苦澀的黃酮及其衍生物類化合物和生物堿中的次黃嘌呤等在2018年茶葉中含量較高；呈味苦澀但能增強回甘和增強鮮味的物質，如兒茶素類物質、生物堿中的脫氧肌苷單磷酸等在2021年茶中含量較高；而2020年茶介于2018和2021年之間，呈味苦澀但能增強回甘和增強鮮味的物質較2021年茶中較少，而呈味苦澀的物質較2018年的較少。

綜上，經過4 a人工管理后，2021年采摘的普洱生茶的品質、口味和保健功效均有大幅提升。本研究為解析從荒廢到人工管理轉變過程中普洱茶內含物質的變化規律提供了理論和物質基礎。