傳統與強化發酵羊肉香腸微生物多樣性及代謝物差異分析

田海勇，蘇 偉,2,*，母應春,2，姜 麗，趙 馳

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

發酵香腸是自然或人工控制條件下利用微生物發酵制成的具有良好貯藏性和特殊風味的肉制品。羊肉因其低脂肪、低膽固醇和高優質蛋白等屬性優于豬肉[1]。以羊肉為原料，添加香辛料經拌料、腌制、灌腸、發酵、干燥等工藝生產的羊肉香腸營養價值高于傳統的豬肉香腸。然而，傳統發酵羊肉香腸存在生產周期長、品質不穩定、易受雜菌污染等問題，限制了羊肉發酵香腸標準化和規模化生產。為提高香腸風味品質，且滿足消費者對營養健康追求，外源微生物被作為發酵劑用于制作香腸[2]。

目前，發酵劑廣泛應用于肉制品中，通過接種特定發酵劑可以提高產品品質；促進醛類、酯類、醇類等良好風味物質形成。此外，添加發酵劑還可縮短成熟時間，提高產品安全性[3]。研究表明，乳酸菌作為發酵香腸中活性微生物在不同類型發酵香腸中具有促進蛋白質水解和積累小分子肽的作用，還可利用碳水化合物產生的乙酸、甲酸、琥珀酸，使香腸具有特殊風味[4]。其次，乳酸菌，尤其是乳酸菌屬和片球菌屬，可產生有機酸，主要是乳酸和乙酸，使肉糜酸化，抑制大多數有害食品微生物生長[5]。如，曾志剛等[6]從香腸中分離得到了產細菌素的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。在許多發酵香腸制品，如意大利[7]、希臘[8]等香腸表面都發現了霉菌，這些霉菌的生長，為香腸提供了特有風味。米根霉（Rhizopus oryzae）在共同培養下生長不受乳酸菌抑制，可明顯促進乳酸菌生長，且其代謝的酶具有分解蛋白和脂肪的能力，對產品風味形成有重要作用[9]。

高通量測序（high throughput sequencing，HTS）技術是分析復雜環境中微生物群落及相對豐度的重要工具，被廣泛用于發酵食品微生物多樣性的研究[10]。如Hu Yingying等[11]通過HTS研究發現，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為東北5 個地區干香腸的優勢菌門。代謝組學是一種旨在全面監測內源性代謝產物的新型組學技術，在近幾十年發展迅速[12]；其中，高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）法具有檢出限低、靈敏度高等優點，可同時用于定性和定量分析，已在食品雜環胺檢測[13]、代謝物檢測[14]等諸多領域廣泛應用，適用于香腸中非揮發性成分的檢測分析。目前文獻多以探究羊肉香腸微生物多樣性和揮發性風味物質為主[15-16]，關于傳統和強化發酵羊肉香腸中核心微生物挖掘鮮有報道。

本研究采用HTS技術、頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）和HPLC-MS/MS技術對傳統與強化發酵羊肉香腸中微生物群落及代謝物差異進行分析，并評價微生物與顯著差異代謝物（significantly differential metabolites，SDMs）之間的關系，以期為羊肉香腸中功能微生物的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊瘦肉、羊肥膘 貴州麻陽河食品有限責任公司；食鹽、蔗糖、白酒、腸衣 貴州省花溪區合力超市；乳酸片球菌 中國工業微生物發酵劑保藏管理中心；米根霉 廣東省微生物發酵劑保藏管理中心。

E.Z.N.A.?Soil DNA提取試劑盒 美國Omega BioTek公司；FastPfu聚合酶 北京全式金生物技術有限公司；建庫試劑盒 美國Bioo Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

Quantus? Fluorometer微型熒光計 美國Promega公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；MiSeq測序儀美國Illumina公司；Trace1300-TSQ8000氣相色譜-質譜聯用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵羊肉香腸的制備

菌液及羊肉香腸的制備參考李靜雯[17]的方法。以傳統（不添加菌種）為對照組。每個樣品重復制備3 次。

乳酸片球菌按說明書活化2 代，接種于乳酸片球菌種子培養基中，37 ℃培養24 h，再從種子培養基中取2%菌液加入擴大培養基中，37 ℃培養24 h，6 000 r/min離心10 min，去上清液，用生理鹽水清洗3 次，加入無菌水，調整活菌數至 108CFU/mL。

米根霉按說明書活化2 代，轉接至斜面培養基中，30 ℃培養3 d，取斜面培養基加入5 mL無菌水并輕輕刮下孢子，重復清洗3 次，合并孢子液反復振蕩后用帶有滅菌脫脂棉的漏斗過濾，得到孢子液，調整孢子液濃度為107CFU/mL。

傳統發酵（CT）：羊肉瘦肥質量比8∶2，加入2%鹽、0.7%蔗糖、1.5%高度白酒、15%冰水（4 ℃冷藏1 d）。

強化發酵（QH）：羊肉瘦肥質量比8∶2，加入2%鹽、0.7%蔗糖、1.5%高度白酒、15%冰水（4 ℃冷藏1d），2%復配菌液（復配比為乳酸片球菌-米根霉1∶1）。

1.3.2 總DNA 提取和PCR擴增

按E.Z.N.A.?Soil試劑盒說明書進行總DNA抽提。用正反引物（338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rRNA的V3-V4可變區進行PCR擴增，真菌使用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）在ITS1區進行PCR擴增。擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.3.3 揮發性物質分析

色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，不分流模式。升溫程序：50 ℃保持5 min，以5 ℃/min速率升至200 ℃，最后以20 ℃/min的速率升至250 ℃并保持10 min。

質譜條件：電子電離源，電子能量為70 eV，傳輸線和離子源溫度為280 ℃和230 ℃，掃描范圍m/z50～450。

定量分析：以20 μg/mL環己酮為內標，采用內標法計算樣品中各物質含量，公式如下：

式中：Ci和Ai分別為待測揮發性物質含量/（μg/kg）和峰面積；Cis和Ais分別為內標物含量/（μg/kg）和峰面積。

1.3.4 非揮發性物質分析

1.3.4.1 代謝物提取

將50 mg樣品4 ℃、10 000 r/min 離心15 min，移取上清液10 μL至EP管，加入含有內標（L-2-氯苯丙氨酸，2 μg/mL）的1 000 μL提取液（乙腈∶甲醇∶水=2∶2∶1）。在30 s渦旋后，在冰浴超聲5 min，重復2 次以上操作。在－40 ℃孵育1 h后于4 ℃、10 000 r/min離心15 min。將825 μL上清液移至新管，在真空濃縮器中于37 ℃干燥水分。在200 μL 50%乙腈溶液中重構10 min。將構造物4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取75 μL上清液于進樣瓶中用于HPLC-MS/MS分析。

1.3.4.2 非揮發性代謝物分析

使用配有UPLC BEH Amide柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）的Waters 1290 Infinity系列超高效液相色譜系統進行分離。流動相由25 mmol/L乙酸銨-25%氫氧化銨溶液（pH 9.75）（A）和乙腈（B）組成。梯度洗脫（0～0.5 min，5% A、95% B；0.5～0.7 min，5%～35% A、95%～65% B；7.0～8.0 min，35%～60% A、65%～40% B；8.0～9.0 min，35% A、40% B；9.0～9.1 min，60%～5% A、40%～95% B；9.1～12.0 min，5% A、95% B）；柱溫25 ℃；進樣器溫度4 ℃，進樣體積1 μL。TripleTOF 6600質譜用于在HPLC-MS/MS實驗期間在信息依賴性下獲取MS/MS譜圖。電噴霧離子源設定如下：氣體1為60 psi，氣體2為60 psi，簾幕氣體為35 psi，源溫度為600 ℃，去聚集電位為60 V，離子噴霧電壓浮動為5 000 V。

1.4 數據處理

利用Student’sttest確定P＜0.05的顯著性水平。使用SIMCA 14.1對代謝物數據集進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。基于OPLS-DA模型，以差異倍數（fold change，FC）結合變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值大于1的代謝物作為SDMs（|FC|＞2，P＜0.05，VIP＞1）。Cytoscape v3.8.2用于相關性網絡可視化。

2 結果與分析

2.1 羊肉香腸微生物多樣性分析

采用Illumina MiSeq測序對傳統和強化發酵羊肉香腸微生物群落組成進行檢測。質量過濾后，所有樣品細菌和真菌分別獲得216 815 條和309 844 條優列。由圖1和表1可知，基于可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的稀釋曲線趨于平坦，且覆蓋率均大于99%，說明獲得的序列足以代表每個樣本的多樣性[18]。

圖1 CT和QH細菌（A）和真菌（B）稀釋性和Shannon指數曲線Fig. 1 Rarefaction and Shannon index curves of bacteria (A) and fungi (B)in naturally fermented and starter culture-fermented mutton sausages

分別用Chao 1指數和Shannon指數描述樣本中微生物群落的物種豐富度和多樣性[19]。如表1所示，在細菌豐富度和多樣性方面，QH組Chao 1和Shannon指數均高于CT組，但無顯著差異，表明強化發酵對細菌的豐富度和多樣性無顯著影響。在真菌豐富度和多樣性方面，CT組Chao 1指數略大于QH組，而QH組Shannon指數顯著高于CT組（P＜0.05），表明強化發酵對真菌多樣性影響顯著。

表1 樣品中微生物的物種豐富度和多樣性分析Table 1 Species richness and diversity analysis of microorganisms in sausage samples

2.2 羊肉香腸中菌群組成分析

根據OTU在不同分類水平的物種分類信息，由圖2A可知，CT和QH均以厚壁菌門（Firmicutes）為優勢細菌門，在CT和QH中分別占91.46%和77.49%；Kamilari等[20]也在研究中發現厚壁菌門為優勢菌。真菌方面，子囊菌門（Acomycota）為CT和QH的優勢真菌門，分別占99.86%和99.11%；Wen Rongxin等[21]研究發現哈爾濱干香腸中真菌以子囊菌門為主。此外，QH組接合菌亞門（Mucoromycota，0.33%）高于CT組（0.01%），這可能與QH中接種的米根霉適應發酵環境快速繁殖有關。

在屬水平上共鑒定出43 個細菌屬，選取平均豐度前10的屬進行分析。由圖2B1可知，CT以明串珠菌屬（Leuconostoc，71.77%）占優勢，其次為拉恩氏菌屬（Rahnella，5.88%）。QH以明串珠菌屬（30.72%）、環絲菌屬（Brochothrix，24.65%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter，19.12%）、片球菌屬（Pediococcus，13.59%）占優勢。與CT（71.77%）相比，QH（30.72%）組明串珠菌屬占比減小，而片球菌屬占比顯著增大（CT：0.57%；QH：13.59%），可能是明串珠菌屬與接種的乳酸片球菌在發酵環境中存在拮抗或營養競爭。本研究鑒定出多個乳酸菌，如明串菌屬、片球菌屬、腸球菌屬（Enterococcus）、unspecified_Lactobacillales和肉桿菌屬（Carnobacterium）。有研究報道乳酸菌是發酵香腸中的主要優勢細菌，不僅通過發酵產生細菌素，還參與生化反應（如糖酵解、蛋白質水解和脂解）對發酵制品pH值變化及風味物質的產生至關重要[22]。此外，還檢測出一些條件致病菌（如拉恩氏菌屬、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、unspecified_Enterobacteriaceae），它們在QH組相對豐度均小于CT組；該結果表明強化發酵不僅影響細菌豐度變化，也有利于提高產品安全性。

樣品中共檢測出33 個真菌屬，選取豐度前10的真菌進行分析（圖2B2）。德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）是兩組香腸中的優勢屬，但其在CT組（94.78%）的相對豐度顯著高于QH組（58.99%）。青霉菌屬（Penicillium，32.44%）是QH組中第2優勢屬；說明強化發酵對羊肉香腸的優勢真菌有重要影響。強化發酵后，樣品中曲霉屬（Aspergillus）、unspecified_Aspergillaceae、unspecified_Capnodiales、unspecified_Pleosporales、根霉屬（Rhizopus）等豐度均高于CT組。這些結果表明強化發酵對真菌群落結構產生影響，提高了物種多樣性和復雜性，這與上述真菌多樣性結果一致。

圖2 香腸樣品中細菌、真菌在門水平（A）和屬水平（B）上的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of bacteria and fungi at phylum (A) and genus levels (B) in sausage samples

2.3 傳統與強化發酵香腸中揮發性物質分析

2.3.1 傳統與強化發酵香腸揮發性物質組成

如表2所示，所有共鑒定出76種揮發性組分，包含酯類17種、醛類16種、醇類13種、烴類10種、酸類8種、酮類3種及其他類9種。其中CT組66種，以醛類為主，QH組70種，以酯類和醛類為主。

酯類主要由醇類和酸類發生酯化反應生成，對發酵香腸風味有特殊貢獻[23]。兩組香腸中酯類存在顯著差異，QH組中酯類含量為300.82 μg/kg，較CT組（73.56 μg/kg）顯著提高。癸酸乙酯和辛酸乙酯為樣品中主要酯類，而乙酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯僅在QH組中檢出，它們分別呈果香、酒香、菠蘿味、蜂蜜香[24]。表明強化發酵對羊肉香腸特有風味形成有重要作用。

兩組香腸中醛類占比較大，均達到35.75%以上。說明醛類是香腸中的主要風味物質，由于其閾值較低對香腸風味有重要作用。兩組香腸中壬醛（柑橘味）、苯甲醛（焦糖味）、反式-2-壬醛（黃瓜味）含量均較高[25]。己醛具青草味，其含量可反映脂肪氧化程度。QH組己醛含量為56.06 μg/kg，是CT（10.35 μg/kg）的5.4 倍；此結果表明強化發酵促進了香腸醛香味的生成。

醇類和酸類是香腸中重要的揮發性物質。醇類源于微生物對糖的代謝或脂類的氧化和降解。本研究共鑒定出12種醇，其中1-辛烯-3-醇（（15.66±0.65）μg/kg）是QH組中含量最高的醇類，是CT組的2.9 倍。1-辛烯-3-醇由脂質氧化形成，具有較低的閾值，呈典型的蘑菇味[26]。酸類可能來源于甘油和磷脂的氧化降解及美拉德反應，短鏈酸由于其低嗅覺閾值而在香氣形成中起重要作用；而較長鏈酸，如辛酸閾值較高，不會直接影響香腸的風味感知，但其可作為其他風味的前體[27]。本研究發現，CT組酸類和醇類顯著高于QH組，可能是強化發酵促進了QH組中酸和醇類物質發生酯化反應生成酯，這一推斷與上述酯類物質含量變化結果一致。此外，兩組香腸中烴類、酮類和其他類代謝物含量無顯著差異。

表2 CT和QH中揮發性成分Table 2 Volatile components in sausage samples

續表2

續表2

2.3.2 多元統計分析

圖3 CT和QH中揮發性代謝物OPLS-DA得分圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig. 3 OPLS-DA score (A) and permutation test (B) plots for volatile metabolites in sausage samples

2.3.3 傳統與強化發酵香腸顯著差異揮發性代謝物變化分析

基于OPLS-DA結果，以|FC|＞2且VIP＞1、P＜0.05為指標，共篩選出29種SDMs（表3），其中上調的物質有14種，包含酯類7種、醇類3種、醛類2種、烯烴1種和2-甲基戊酸酐1種。下調的物質有15種，包括醛類2種，醇類5種，酸類5種，烷烴、酮類和醚各1種。

表3 CT和QH中揮發性SDMs分析Table 3 Analysis of significantly differential volatile metabolites in sausage samples

2.4 傳統與強化發酵羊肉香腸中非揮發性代謝物分析

2.4.1 傳統與強化發酵香腸非揮發性代謝物分析

采用配備Q-TOF高分辨率分析儀的HPLC-MS/MS對兩組香腸樣品進行分析。結果顯示，共鑒定出375種非揮發性代謝物，有氨基酸及其衍生物108種、生物堿59種、有機酸及其衍生物54種、萜類44種、酯類32種、核酸及其衍生物18種、甾體18種、維生素及其衍生物13種、碳水化合物9種、其他20種。

圖4 CT與QH中非揮發性代謝物OPLS-DA得分圖（A）和置換檢驗（B）Fig. 4 OPLS-DA score (A) and permutation test (B) plots for nonvolatile metabolites in sausage samples

為更好地了解樣品組間的非揮發性代謝物，進行了OPLS-DA。由圖4可知，兩組樣品完全分離，模型和Q2值分別為0.924、0.992和0.984。說明模型構建成功，具有很高的擬合度和預測能力，適合探索不同發酵方式下羊肉香腸的非揮發代謝物差異。

2.4.2 傳統與強化發酵香腸顯著差異非揮發性代謝物變化分析

基于OPLS-DA結果，以|FC|＞2且VIP＞1、P＜0.05為指標，共篩選出16種SDMs（表4），其中上調9種，有氨基酸及其衍生物3種，有機酸4種，生物堿和萜類物質各1種；下調7種，包括碳水化合物2種，核酸及其衍生物2種，生物堿、維生素及其衍生物、酯類各1種。

表4 CT和QH中非揮發性SDMsTable 4 Significantly differential non-volatile metabolites in sausage samples

2.5 羊肉發酵香腸微生物與SDMs的相關性分析

羊肉發酵香腸中代謝物的產生與微生物活動密不可分，為挖掘與羊肉香腸SDMs呈強相關性的核心微生物。基于Pearson相關系數揭示微生物與SDMs之間的相關性。圖5A表明，7 個細菌屬（明串珠菌屬、環絲菌屬、片球菌屬、嗜冷桿菌屬、腸球菌屬、拉恩氏菌屬和葡萄球菌屬）與SDMs高度相關（|r|＞0.8，P＜0.05）。其中明串珠菌屬、片球菌屬、腸球菌屬和葡萄球菌屬已經被證實為發酵香腸中的重要細菌屬，它們在香腸發酵和成熟過程中發揮著重要的作用。乳酸菌的酸化作用對羊肉香腸發酵過程中風味發展和不良菌群的控制具有重要作用[20]。明串珠菌屬、嗜冷桿菌屬分別與40種和42種SDMs具有強相關性，表明它們對香腸風味形成有重要貢獻作用。其中明串珠菌屬與麥芽糖、海藻糖、煙酰胺、肌苷和次黃嘌呤呈強正相關，與酯類、醛類、氨基酸和醇類呈強負相關。這與Lee等[28]研究結果不符，可能是由其與QH中接種的乳酸片球菌存在競爭關系導致。嗜冷桿菌屬與酯類（V1～V6）、氨基酸（N1～N5）、醛類、醇類呈正相關，與酸類、碳水化合物、肌苷和次黃嘌呤呈負相關；這可能與其能水解蛋白質和分解脂類有關[29]。環絲菌屬與D-脯氨酸、鳥氨酸、DL-正纈氨酸和月桂烯呈正相關，與正十五烷呈負相關。此外，葡萄球菌屬、拉恩氏菌屬雖為條件致病菌，但它們可以產生一系列酶，有助于風味形成。據報道，葡萄球菌屬蛋白酶和脂肪酶活性較高，有助于發酵肉制品中特征風味的生成[30]。

圖5B顯示，7 個真菌屬（德巴利氏酵母屬、青霉屬、曲霉屬、unspecified_Aspergillaceae、unspecified_Capnodiales、根霉屬和unspecified_Basidiomycota）與SDMs高度相關（|r|＞0.8，P＜0.05）。曲霉屬、德巴利氏酵母屬、青霉屬分別與43、25、21種SDMs具有強相關性，對香腸風味形成貢獻較大。曲霉屬與酯類（V1～V7）、D-脯氨酸、硬脂炔酸、鳥氨酸、3-吲哚乙酸等呈強正相關，與碳水化合物、酸類和醇類呈負相關。曲霉屬能夠分泌糖化酶用以分解淀粉，是傳統發酵食品中與風味形成相關的重要微生物[31]。青霉屬與酯類（V2～V7）、正己醛、1-辛烯-3-醇等呈正相關，與碳水化合物、次黃嘌呤、肌苷等呈負相關。Mu等[32]研究發現青霉屬與有機酸密切相關。而有機酸可進一步與醇類反應形成酯。德巴利氏酵母屬與大多數醇類和酯類之間呈強負相關，這與陳倩等[33]研究發現一致，unspecified_Capnodiales與癸酸乙酯和棕櫚酸乙酯呈強正相關。根霉菌屬與DL-正纈氨酸呈強正相關。這可能與米根霉能在適宜條件下產蛋白酶有關[34]。unspecified_Basidiomycota與9,10-二羥基-12(Z)-十八碳烯酸呈正相關，而unspecified_Aspergillaceae與單油酸甘油酯呈負相關。

圖5 細菌（A）、真菌（B）與SDMs間相關性網絡圖Fig. 5 Correlation network diagrams for bacteria (A) and fungi (B)versus SDMs

3 結 論

以不同發酵方式下的羊肉香腸為研究對象，采用Illumina HTS技術結合代謝組學分析其微生物組成和代謝產物之間的差異，并通過相關性分析確定香腸中與代謝物形成相關的核心微生物。結果表明，強化發酵顯著影響了羊肉香腸菌落結構及微生物豐度，在屬水平上，傳統發酵中明串珠菌屬、環絲菌屬和德巴利氏酵母屬為主要微生物；而強化發酵中的主要微生物為明串珠菌屬、環絲菌屬、嗜冷桿菌屬、片球菌屬、德巴利氏酵母屬和青霉屬。從兩種香腸中分別篩選出29種揮發性和16種非揮發性代謝物為SDMs。相關性結果顯示，7 個細菌屬（明串珠菌屬、環絲菌屬、片球菌屬、嗜冷桿菌屬、腸球菌屬、拉恩氏菌屬和葡萄球菌屬）和7 個真菌屬（德巴利氏酵母屬、青霉屬、曲霉屬、unspecified_Aspergillaceae、unspecified_Capnodiales、根霉屬和unspecified_Basidiomycota）被視為兩種羊肉香腸的核心微生物。這為羊肉香腸產品功能微生物的研究奠定了理論基礎。