布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白生物信息預(yù)測(cè)

薄雅寧，莊添瑞，高 玥，孫靖楠，胡 海，王 銳，高志祥，于 慧*

（1.包頭醫(yī)學(xué)院烏蘭察布臨床醫(yī)學(xué)院；2.包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院；3.包頭醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院；4.包頭醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院；5.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；6.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

布魯氏菌（Brucella）是一種胞內(nèi)寄生革蘭氏陰性菌，布魯氏菌所致的布魯氏菌病為一種人畜共患病。布魯氏菌的自然宿主以牛、羊等家畜以及人類為主。感染會(huì)導(dǎo)致家畜的睪丸炎、流產(chǎn)或不孕不育；人感染后引發(fā)波狀熱，臨床并發(fā)心內(nèi)膜炎、肝脾腫大、關(guān)節(jié)病變或骨髓增生等，以生殖系統(tǒng)疾病為多[1]。隨著研究不斷進(jìn)展，根據(jù)宿主偏好性和生化表型對(duì)布魯氏菌的分類也越來越多，但是人類對(duì)于防治布魯氏菌依然沒有效果較為理想的疫苗。

外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMP）是一種僅存在于革蘭氏陰性菌中的特殊蛋白質(zhì)，通常具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，位于細(xì)菌外膜，該跨膜結(jié)構(gòu)域是細(xì)菌存活和毒力發(fā)揮的關(guān)鍵因素，主要包括OmpA、OmpW等[2]。由于布魯氏菌的外膜蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，所以布魯氏菌可以逃避巨噬細(xì)胞的免疫監(jiān)控與反應(yīng)。細(xì)胞死亡分析顯示，T4SS效應(yīng)VceC和兩個(gè)不同的分泌蛋白OmpW家族蛋白（BAB1_1579和蛋白BAB1_1185）與布魯氏菌細(xì)胞毒性有關(guān)。這項(xiàng)研究提出對(duì)于布魯氏菌細(xì)胞毒性相關(guān)的分子機(jī)制新的見解和為布魯氏菌篩選候選疫苗的篩選提供有價(jià)值的信息[3]。

對(duì)布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可以進(jìn)一步了解OmpW家族蛋白基因表達(dá)、蛋白質(zhì)特性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能、免疫學(xué)特性等相關(guān)信息，為日后深入研究其作用提供更多理論依據(jù)，也為研發(fā)更加安全有效的布魯氏菌疫苗和臨床治療藥物提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

從NCBI-Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）基因數(shù)據(jù)庫找到不同種布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列。

1.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析運(yùn)用在線分析工具ProtPararm （https://web.expasy.org/protparam/）分析布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的一些物理和化學(xué)參數(shù)，如氨基酸和原子組成、正負(fù)電荷殘基數(shù)、分子量、等電點(diǎn)、分子式、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪族指數(shù)、親水性系數(shù)等。

1.2 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽預(yù)測(cè)運(yùn)用TMHMM預(yù)測(cè)布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；使用novopro網(wǎng)站（https://novopro.cn/tools/signalp）預(yù)測(cè)布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的信號(hào)肽。

1.3 蛋白質(zhì)的糖基化及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)通過NetPhos3.1 （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）預(yù)測(cè)布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白磷酸化作用位點(diǎn)，采用NetNGlyc1.0在線分析布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白糖基化作用位點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過UCL（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）在線分析工具預(yù)測(cè)布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及建模利用在線軟件SWIWW-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive/GBJVfy/models/）預(yù)測(cè)并建立布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.6 B、T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)通過ABCPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）預(yù)測(cè)布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的B細(xì)胞抗原表位；通過NetMHCcons-1.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCcons-1.1）預(yù)測(cè)該蛋白的T細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 不同種布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因序列從NCBI-Gene數(shù)據(jù)庫中獲得馬耳他氏布魯氏菌、豬布魯氏菌、犬布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌、中間型布魯氏菌中外膜蛋白OmpW家族蛋白基因序列，見表1。

表1 各類布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因ID

以上6種布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因一致，共有684個(gè)堿基，基因序列NCBI-Gene基因數(shù)據(jù)庫中可查詢。

2.2 OmpW家族蛋白的氨基酸序列OmpW家族蛋白基因編碼蛋白共含有227個(gè)氨基酸殘基，見表2。

表2 各氨基酸比例數(shù)目

2.3 OmpW家族蛋白的理化性質(zhì)ProtPararm在線分析工具分析布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白理化性質(zhì)。布魯氏菌外膜蛋白OmpW分子式為C1136H1717N281O321，脂肪族指數(shù)為91.63，理論pI值為5.67，原子總數(shù)為3 457，其氨基酸序列Ala（A）占12.3%、Gly（G）占10.6%。正電荷殘基（Arg+Lys）、負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)分別為16和18，其不穩(wěn)定系數(shù)為23.01。該蛋白為穩(wěn)定蛋白，親水性系數(shù)為GRAVY為0.143。體外哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞半衰期是30 h，酵母體內(nèi)半衰期為＞20 h，大腸桿菌體內(nèi)半衰期＞10 h。

2.4 OmpW家族蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽預(yù)測(cè)經(jīng)過TMHMM Server v.2.0對(duì)于布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示在其7～29位氨基酸處存在有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，見圖1。

圖1 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

經(jīng)novopro網(wǎng)站進(jìn)行OmpW蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示有信號(hào)肽的概率為：96.481%，信號(hào)肽類型：SP（Sec/SPI）；切割位點(diǎn)：26～27，概率：97.400%。

2.5 OmpW家族蛋白的糖基化和磷酸化分析經(jīng)過NetPhos3.1進(jìn)行布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)存在17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別位于第15、87、98、132、148、156、209、221、224位蘇氨酸（T）；位于第61、72、100位酪氨酸（Y）；位于第43、66、68、73、108位絲氨酸（S）等氨基酸處（見圖3）；并存在1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，位于第146位（0.6939）氨基酸處（見圖4）；沒有發(fā)現(xiàn)存在O-糖基化位點(diǎn)。

圖3 磷酸化位點(diǎn)

圖4 糖基化位點(diǎn)

2.6 OmpW家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中有鏈（Strand）13個(gè)，螺旋（Holix）2個(gè)，卷曲（Coil）16個(gè)，見圖5、圖6。

圖5 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖6 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

信號(hào)肽序列：MPWMNRFARGLLAATALTFAAPAAFA，見圖2。

圖2 信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.7 OmpW家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用在線軟件SWIWW-MODEL預(yù)測(cè)并建立布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。其GMQW值為0.52，說明結(jié)果可信度高，預(yù)測(cè)OmpW家族蛋白為單聚體，屬于外膜蛋白家族，見圖7。

圖7 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.8 OmpW家族蛋白的T、B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)通 過ABCPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）預(yù)測(cè)蛋白共有2 4個(gè)B細(xì)胞抗原表位，如2 0 4-219，66-81，144-159，78-93，169-184，35-50等。通過NetMHCcons-1.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service. php?NetMHCcons-1.1）預(yù)測(cè)蛋白的T細(xì)胞抗原表位（HLA-A*02:01），預(yù)測(cè)結(jié)果強(qiáng)結(jié)合肽4個(gè)，弱結(jié)合肽5個(gè)。

3 討論

革蘭氏陰性菌的外膜（outer membrane，OM）外部小葉存在脂多糖，因此是一種保護(hù)性屏障，能阻礙親水性和疏水性化合物的滲透。OMP是促進(jìn)革蘭氏陰性菌攝取細(xì)胞生長和功能所必需的營養(yǎng)和其他分子的通道之一[4]，是一種革蘭氏陰性菌中的特殊蛋白質(zhì)，通常具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，是細(xì)菌存活和毒力發(fā)揮的關(guān)鍵，主要包括OmpA、OmpW等[2]。而外膜蛋白W（OmpW）屬于小外膜孔蛋白家族，由8股反向平行β折疊片形成的桶狀疏水通道[5]，相關(guān)研究表明OmpW家族蛋白與提高細(xì)菌應(yīng)對(duì)各種環(huán)境壓力的能力緊密相關(guān)，如滲透作用[6]、氧化作用[7]、溫度變化及營養(yǎng)匱乏[8]等。同時(shí)，OmpW家族蛋白作為一種毒力因子編碼的蛋白，其在細(xì)菌體內(nèi)合成增多通常表示細(xì)菌毒力的加強(qiáng)，可視為是一種重要的保護(hù)性抗原[9]，由于其在革蘭氏陰性菌中具有較高的保守性，在病菌感染和宿主免疫反應(yīng)的激活方面起重要作用，應(yīng)成為疫苗研發(fā)的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。目前，關(guān)于大腸桿菌OmpW家族蛋白基因的研究較多，而對(duì)于布魯氏桿菌OmpW基因鮮有報(bào)道。有研究表明，布魯氏菌外膜蛋白免疫原性較好，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫，可作為疫苗構(gòu)建的候選物[10]，鑒于此，本研究對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步研究布魯氏桿菌的疫苗研發(fā)提供理論 依據(jù)。

布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白分子式為C1136H1717N281O321，脂肪族指數(shù)為91.63，理論pI值為5.67，原子總數(shù)為3457，其氨基酸序列Ala（A）占12.3%，Gly（G）占10.6%。Arg+Lys、Asp+Glu總數(shù)分別為16和18，其不穩(wěn)定系數(shù)為23.01，可以認(rèn)為布魯氏桿菌外膜蛋白OmpW家族蛋白具有較好的穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)，在該蛋白7～29位氨基酸處存在有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。本研究預(yù)測(cè)該蛋白在細(xì)胞中起著通道蛋白的作用。該蛋白有96.481%的概率存在信號(hào)肽，信號(hào)肽指引蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的方式有兩種，轉(zhuǎn)運(yùn)后由三種信號(hào)肽酶進(jìn)行切除，該蛋白存在的信號(hào)肽為常規(guī)的分泌通路和Ⅰ型信號(hào)肽酶。

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學(xué)過程密切相關(guān)，如DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等。布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白存在17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，存在1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，沒有發(fā)現(xiàn)存在O-糖基化位點(diǎn)。該預(yù)測(cè)為進(jìn)一步解析OmpW家族蛋白磷酸化在調(diào)控布魯氏菌轉(zhuǎn)錄與復(fù)制過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

通過分析布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)其折疊比例最高，蛋白質(zhì)折疊機(jī)制一直是一項(xiàng)研究熱點(diǎn)，蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊可能導(dǎo)致新生肽鏈的降解或蛋白活性的消失，因此，我們猜測(cè)誘導(dǎo)布魯氏桿菌OmpW家族的錯(cuò)誤折疊可以破壞其穩(wěn)定性，降低殺死此菌的難度。

抗原表位的研究，擁有重要的意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。預(yù)測(cè)顯示布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族共有24個(gè)B細(xì)胞抗原表位，T細(xì)胞抗原表位（HLA-A×02∶01）有強(qiáng)結(jié)合肽4個(gè)，弱結(jié)合肽5個(gè)。該蛋白抗原表位較多，有一定的抗原性，可以作為潛在的布魯氏菌感染抗原候選分子，為研發(fā)布病新藥靶點(diǎn)及新型疫苗制備提供新的方向。

通過上述研究，我們有效實(shí)現(xiàn)了布魯氏外膜蛋白OmpW家族蛋白生物信息的預(yù)測(cè)分析。該蛋白質(zhì)由227個(gè)氨基酸殘基組成，原子總數(shù)為3 457，等電點(diǎn)為5.67，整體表現(xiàn)為非親水性的穩(wěn)定蛋白；該蛋白存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；含有1個(gè)N-糖基化和17個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)； 二級(jí)結(jié)構(gòu)中有鏈（Strand）13個(gè)、螺旋（Holix）2個(gè)、卷曲（Coil）16個(gè)。以上研究表明布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白在細(xì)菌感染和宿主免疫反應(yīng)的激活方面有著重要作用，為深入解析OmpW家族蛋白在布魯氏菌在侵染過程中發(fā)揮的作用及研發(fā)更加安全有效的布魯氏菌疫苗和臨床治療藥物提供了一定理論基礎(chǔ)。