外周血T 細(xì)胞亞群和ST2L 在NSCLC 抗PD-1 治療中的變化

許 姣，湯建磊，李小虹（通信作者）

（1 江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院<徐州醫(yī)科大學(xué)武進(jìn)臨床學(xué)院>呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 江蘇 常州 213000）

（2 江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院<徐州醫(yī)科大學(xué)武進(jìn)臨床學(xué)院>重癥監(jiān)護(hù)室 江蘇 常州 213000）

（3 江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院<徐州醫(yī)科大學(xué)武進(jìn)臨床學(xué)院>醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科 江蘇 常州 213000）

肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，2 0 1 8 GLOBOCAN 的數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)肺癌患者約209 萬例，死亡176 萬例[1]，我國肺癌發(fā)病率每年增長26.9%，2015年新診斷肺癌73.3萬例，61萬人死于肺癌[2]。在腫瘤微環(huán)境中，細(xì)胞程序性死亡受體1（PD-1）及其配體PD-L1 結(jié)合開啟腫瘤免疫抑制程序，是免疫調(diào)節(jié)的重要組成部分。T 細(xì)胞是抗腫瘤免疫應(yīng)答中的核心執(zhí)行者，腫瘤細(xì)胞的PD-L1 蛋白與T 細(xì)胞上的PD-1 受體結(jié)合可傳導(dǎo)抑制信號，限制T 細(xì)胞的活化、增殖、細(xì)胞毒性及細(xì)胞因子的分泌，下調(diào)抗腫瘤免疫應(yīng)答，開啟免疫逃逸。以納武利尤單抗、帕博利珠單抗等為代表的PD1 抑制劑成為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療新選擇[3-4]。因此，篩選免疫治療的最有效預(yù)測因子的研究亟需進(jìn)一步開展。ST2（生長刺激表達(dá)基因2 蛋白）位于2 號染色體，可編碼ST2L、sST2、ST2V 和ST2LV 蛋白[5-6]。ST2L 主要表達(dá)于Th 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞等參與細(xì)胞增殖，而sST2 可能起到負(fù)性作用[7]。本研究者前期研究已證實(shí)NSCLC 癌組織中ST2 基因和ST2 蛋白高表達(dá)，且在非小細(xì)胞肺癌中ST2 介導(dǎo)了Th1/Th2 細(xì)胞因子漂移[8]。但目前免疫治療的療效預(yù)測標(biāo)記物尚未明確，腫瘤組織中PD-L1 表達(dá)水平、錯(cuò)配基因修復(fù)蛋白（MMR）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）、腫瘤組織的突變負(fù)荷（TMB）等都可成為免疫治療療效的預(yù)測指標(biāo)，但其預(yù)測能力尚存爭議[9-10]。本研究旨在探討晚期非小細(xì)胞肺癌患者抗PD-1 治療前后CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、ST2L 水平變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1 月—2022年1 月江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院行抗PD-1 治療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者30 例為肺癌組，選取同期30 名體檢健康者作為對照組。肺癌組男2 2例，女8 例；≥8 0歲7 例，＜8 0歲2 3例；吸煙≥600 支/年者20 例，＜600 支/年者10 例。對照組中男2 2例，女8 例；≥8 0歲5 例，＜8 0歲2 5例；吸煙≥600 支/年者18 例，＜600 支/年者12 例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①肺癌組病理組織學(xué)明確診斷為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）；②EGFR、ALK 陰性NSCLC；③ECOG 評分0 ～2 分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往合并嚴(yán)重肝腎功能損害；②患有自身免疫系統(tǒng)疾病。所有患者均接受至少2 周期抗PD-1 治療，并簽署知情同意書。

1.2 方法

（1）TIMER（Tumor Immune Estimation Resource）數(shù)據(jù)庫。TIMER 數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析提示在NSCLC 中ST2 與CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞的相關(guān)性，通過ssGSEA 方法，得到每個(gè)樣品中免疫相關(guān)基因集打分（免疫基因集包括免疫細(xì)胞類型、功能和通路）。通過聚類分析，將樣品分為兩組，即高免疫組（Immunity_H）、低免疫組（Immunity_L），然后分析每個(gè)免疫組ST2 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ST2 可能和免疫治療療效密切相關(guān)。具體步驟：①通過TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載和整理數(shù)據(jù)；②ssGSEA 分析，得到每個(gè)樣品免疫打分；③根據(jù)ssGSEA 打分，對樣品分組，得到2 個(gè)免疫分組（Immunity_H、Immunity_L）；④免疫分組和ST2 的相關(guān)性。（2）治療方法。肺癌組患者均接受PD-1單抗治療，用藥方法：信迪利單抗200 mg/次靜滴，21 d為1 個(gè)周期或替雷利珠單抗200 mg/次靜滴，21 d 為1 個(gè)周期或卡瑞利珠單抗200 mg/次靜滴，14 d 為1 個(gè)周期。

1.3 觀察指標(biāo)

檢測外周血CD4+、CD8+、ST2L 對照組、肺癌組患者在第1 次抗PD-1 治療前及抗PD-1 治療2，4周期后，空腹抽取外周血5 m L，EDTA 抗凝管，嚴(yán)禁冷藏用，SemiBio 細(xì)胞免疫芯片檢測CD4+、CD8+；離心取細(xì)胞，BSP005 提取膜蛋白，凍存于-20 ℃。按照ELISA 操作步驟，檢測ST2L。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（± s）表示，多組間比較行t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（Q1，Q3）］表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（n）和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 TIMER 數(shù)據(jù)庫分析ST2 與CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞浸潤相關(guān)

TIMER 數(shù)據(jù)庫顯示ST2 和CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)（P＜0.05），見圖1。

圖1 ST2 和CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析

2.2 通過ssGSEA（single sample GSEA）發(fā)現(xiàn)ST2可能和免疫治療療效相關(guān)

通過ssGSEA（single sample GSEA）方法，發(fā)現(xiàn)ST2可能和免疫治療療效密切相關(guān)（P＜0.05，0.001，0.01，0.05“***”，“**”，“*”），見圖2。

圖2 ST2 與免疫治療療效相關(guān)性分析

2.3 各組外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比較

肺癌組抗PD-1 治療前后外周血CD4+細(xì)胞水平、CD4+/CD8+均低于對照組，而CD8+細(xì)胞水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；抗PD-1 治療后外周血CD4+細(xì)胞水平、CD4+/CD8+較治療前有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療前后，CD8+細(xì)胞水平變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比較（ ± s，個(gè)/微升）

表1 各組外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比較（ ± s，個(gè)/微升）

注：肺癌組抗PD1 治療前后兩組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與對照組比較，aP ＜0.05；肺癌組抗PD1 治療后CD4+、CD4+/CD8+與抗PD1 治療前比較，bP ＜0.05。

組別 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+肺癌組治療前 400.63±48.14a 808.33±200.8a 0.52±0.13a肺癌組治療后 539.93±169.09ab 720.67±131.17a 0.80±0.40ab對照組 998.33±428.85 612.67±247.93 1.61±0.47

2.4 各組外周血ST2L 的表達(dá)

與對照組相比，抗PD-1 治療前后NSCLC 外周血低表達(dá)ST2L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且抗PD-1治療后NSCLC 外周血ST2L 表達(dá)量較治療前有明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組外周血ST2L 的表達(dá)

3.討論

有效的免疫反應(yīng)需要腫瘤細(xì)胞和T 細(xì)胞的刺激信號和免疫抑制相互作用維持T 細(xì)胞激活狀態(tài)啟動殺腫瘤細(xì)胞過程[11]。重塑并激活腫瘤微環(huán)境中的免疫作用，逆轉(zhuǎn)T 細(xì)胞耗竭，增強(qiáng)免疫細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的能力是目前PD-1/PD-L1 抑制劑抗腫瘤的作用基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)研究表明NSCLC 外周血CD4+細(xì)胞水平、CD4+/CD8+均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示NSCLC 患者存在免疫功能抑制。抗PD-1 治療后NSCLC 外周血CD4+細(xì)胞水平、CD4+/CD8+較抗PD-1 治療前有顯著增加，提示抗PD-1 治療后NSCLC 免疫抑制有所改善（如表1）。本研究通過生物信息學(xué)方法分析，發(fā)現(xiàn)ST2 與CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞浸潤相關(guān)。與健康人群比較，NSCLC 外周血低表達(dá)ST2L，抗PD-1 治療后外周血ST2L 表達(dá)量明顯增多，提示ST2L 的表達(dá)與PD1 治療相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了ssGSEA（single sample GSEA）方法發(fā)現(xiàn)的ST2 可能和免疫治療療效相關(guān)。

NSCLC 外周血低表達(dá)ST2L 與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，分析可能原因?yàn)椋孩偾捌趯?shí)驗(yàn)檢測的為ST2 基因，本實(shí)驗(yàn)僅檢測了T 細(xì)胞表面的ST2L，推測NSCLC 患者免疫功能低下且大部分T 細(xì)胞被募集至肺癌病灶中發(fā)揮抗腫瘤作用，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。②本樣本量較小，需要擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。抗PD-1 治療后NSCLC 外周血ST2L較治療前增多，結(jié)合抗PD-1 治療后NSCLC 外周血CD4+細(xì)胞水平升高，推測表達(dá)于Th 細(xì)胞表面的ST2L 可能作為非小細(xì)胞肺癌免疫療效預(yù)測標(biāo)志物，需要進(jìn)一步展開研究。