乳腺浸潤性導管癌微環境中CD4+及CD8+T 淋巴細胞的表達及意義

王為東，陳文芳，張 禎

（1 山東省蒙陰縣人民醫院病理科 山東 臨沂 276200）

（2 山東省蒙陰縣人民醫院乳腺甲狀腺外科 山東 臨沂 276200）

乳腺癌是全世界女性癌癥死亡的重要原因之一，其病死率占所有惡性腫瘤的15%[1]。腫瘤微環境作為腫瘤賴以生存的基礎，越來越受到該領域學者的重視。其中CD4+和CD8+淋巴細胞作為腫瘤微環境中的重要淋巴細胞，對腫瘤的預后的評估和治療方法的制定都有重要的意義。本文旨在探討乳腺浸潤性導管癌微環境中CD4+及CD8+T 淋巴細胞的表達及其臨床意義。

1.資料與方法

1.1 一般資料

分析2015 年1 月—2021年12 月于山東省蒙陰縣人民醫院行手術切除的136 例乳腺浸潤性導管癌標本，所有標本經10%中性福爾馬林、石蠟包埋處理。采用免疫組織化學染色方法檢測腫瘤組織中的CD4+、CD8+水平。所有患者均為女性，中位年齡52 歲，組織病理學分級：Ⅰ級4 例，Ⅱ級90 例，Ⅲ級42 例；國際抗癌聯盟TNM分期：Ⅰ期46 例，Ⅱ期51 例，Ⅲ、Ⅳ期39 例。

1.2 方法

①組織芯片構建：根據HE 染色切片選取組織典型部分，選用遼寧朝陽恒泰公司生產的恒泰組織芯片制備系統HT-1 制備蠟塊，取樣針直徑2.0 mm，組織芯片間距1.5 mm。②免疫組織化學染色：采用免疫組化SP 法和羅氏BenchMark GX 全自動免疫組化染色機，CD4+、CD8+鼠抗人單克隆抗體北京中杉金橋公司，二抗采用羅氏公司全自動染色機封閉抗體，對比實驗均設陰性和陽性對照，按說明書操作。

1.3 觀察指標

應用組織芯片及免疫組化技術檢測136 例乳腺浸潤性導管癌微環境中CD4+及CD8+T 淋巴細胞的表達情況，并分析其與臨床病理特征及預后的關系。CD4+和CD8+淋巴細胞陽性表達部位為胞質或包膜，挑選腫瘤間質淋巴細胞浸潤密集區，采用視場數22，物鏡倍數為×40 倍的奧林巴斯BX41 顯微鏡進行觀察。判斷標準：每個40倍視野中CD4+淋巴細胞≥20 個為陽性，＜20 個為陰性；CD8+淋巴細胞≥40 個為陽性，＜40 個為陰性。將不同臨床病理指標與患者的腫瘤大小、淋巴結轉移以及癌細胞的雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）、P53 及Ki-67 等指標進行分析，隨訪時間為24 ～72 個月。

1.4 統計學方法

使用SPSS 22.0 統計軟件進行數據處理。計數資料用頻數和百分率[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料比較采用Z檢驗。經Pearson 檢驗進行相關性分析，采用Log-rank 檢驗進行生存分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2.結果

2.1 CD4+、CD8+淋巴細胞表達與臨床病理指標的關系

CD4+T 淋巴細胞在乳腺浸潤性導管癌微環境中的表達與患者的臨床分期之間差異顯著（χ2= 6.880，P= 0.032），與患者年齡、組織學分級、淋巴結轉移及腫瘤的大小無顯著差異（P＞0.05）；CD8+T 淋巴細胞在乳腺浸潤性導管癌微環境中的表達與患者的淋巴結轉移及臨床分期之間差異顯著（χ2= 4.248、7.496，P= 0.039、0.024），與患者的年齡、組織學分級及腫瘤大小無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 CD4+及CD8+T 淋巴細胞在IDC 微環境中的表達與臨床病理參數的關系

2.2 CD4+、CD8+淋巴細胞與乳腺浸潤性導管癌中ER、PR、HER-2 及Ki-67 表達的相關性

CD4+淋巴細胞在乳腺浸潤性導管癌微環境中的浸潤與ER 呈負相關（r= -0.173，P= 0.045），與HER-2 及Ki-67 呈正相關（r= 0.178、247，P= 0.039、0.004），與PR 無顯著相關性（P＞0.05）。CD8+淋巴細胞在乳腺浸潤性導管癌微環境中的浸潤與ER、PR、HER-2 及Ki-67的表達均無顯著相關性（P＞0.05）。

2.3 CD4+、CD8+淋巴細胞的浸潤與術后無瘤生存和總生存的關系

Log-rank 檢驗顯示，CD4+淋巴細胞在乳腺浸潤性導管癌微環境中的浸潤有延長患者的無瘤生存時間和總生存時間的趨勢，但差異無統計學意義（χ2= 3.05、2.598，P= 0.081、0.089），見圖1、2。CD4+淋巴細胞在乳腺浸潤性導管癌微環境中的浸潤可延長患者的無瘤生存時間和總生存時間，差異有統計學意義（χ2= 5.26、4.445，P= 0.022、0.035），見圖3、圖4。

圖1 CD4+淋巴細胞表達患者無瘤生存時間

圖2 CD8+淋巴細胞表達患者無瘤生存時間

圖3 CD4+淋巴細胞表達患者總生存時間

圖4 CD8+淋巴細胞表達患者總生存時間

3.討論

腫瘤微環境是指腫瘤細胞周圍的生長環境，是腫瘤細胞生長的土壤，包括基質細胞、免疫細胞及其分泌因子、血管內皮細胞及細胞外基質[2]。免疫微環境是指腫瘤局部浸潤各種免疫細胞亞群，包括不同效應的CD4+T細胞亞群，初始和記憶性CD8+T 淋巴細胞、B 淋巴細胞，巨噬細胞，肥大細胞、樹突細胞、自然殺傷細胞及其分泌因子。腫瘤免疫微環境已經被列為腫瘤的十大特征之一[3]。免疫細胞亞群的密度不同，患者的預后也不同。CD3+T 淋巴細胞、細胞毒性性T 細胞和記憶性T 細胞的密度越高，患者的無進展生存時間和總生存時間均顯著延長[4]。在腫瘤生長早期，腫瘤免疫微環境中的免疫細胞及其基質成分形成的炎性微環境有抑瘤作用，可阻礙腫瘤的生長發展。但經過持續的免疫激活反應，微環境中的相關效應細胞處于耗竭或重塑狀態，不能發揮正常的功能，甚至會促進腫瘤的惡性表征，繼而改變免疫抑制性微環境[5]。

乳腺浸潤性癌中的腫瘤浸潤淋巴細胞的形態學評價與臨床關系日益密切。淋巴細胞在腫瘤組織中的浸潤程度可通過HE 染色及免疫組化染色進行評估[6]。浸潤淋巴細胞具有潛在的評估治療效果和預后的價值。早期檢測淋巴細胞浸潤情況適用于患者治療方案的評估和制定，有助于提高治療的針對性、降低復發率，改善患者預后[7]。

機體免疫監視機能的缺失使腫瘤細胞逃避機體的免疫監視是腫瘤的發生基礎，其中由T 細胞和B 細胞介導的獲得性免疫是有效且持續的抗腫瘤應答的關鍵基礎。在腫瘤浸潤淋巴細胞中，T 淋巴細胞的作用尤為重要。CD4+T 淋巴細胞為輔助性淋巴細胞，雖不能直接識別和殺傷腫瘤，但對細胞性T 細胞的活化具有輔助放大效應，間接發揮抗腫瘤作用。CD8+T 淋巴細胞屬于抗腫瘤效應細胞[8]。腫瘤間質淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷主要有2 種途徑：①通過分泌穿孔素和顆粒酶等致使腫瘤細胞自溶的分泌途徑。②通過淋巴細胞的配體與腫瘤細胞的受體結合誘導腫瘤細胞的非分泌途徑。

相關研究表明，在胃癌結腸癌患者外周血中CD4+及CD8+T 淋巴細胞明顯降低顯示預后不佳[9-11]。另有研究表明，CD4+及CD8+T 淋巴細胞越少，腫瘤間質血管的新生能力越強[12]。本文腫瘤微環境中CD4+及CD8+T 淋巴細胞越多，患者的臨床分期越低，CD8+T 淋巴細胞還與患者的腋窩淋巴結轉移相關（P＜0.05）。即腫瘤微環境中CD8+T 淋巴細胞越多，腫瘤腋窩淋巴結轉移率越低。另外，隨著CD8+T 淋巴細胞的增多，患者的無瘤生存時間和總生存時間均延長，差異有統計學意義。以上結果均表明，腫瘤微環境中CD4+及CD8+T 淋巴細胞能預測乳腺浸潤性導管癌患者的預后，這也是腫瘤免疫治療的理論基礎之一。雖然隨著腫瘤微環境中CD4+T 淋巴細胞的增多，患者的無瘤生存時間和總生存時間也有延長的趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。考慮與樣本的數量較少有關，今后將繼續累積樣本進行分析觀察，同時對CD4+及CD8+T 淋巴細胞影響患者預后的機制進行探討。

綜上所述，腫瘤微環境中CD4+及CD8+T淋巴細胞越多，患者的臨床分期越低。腫瘤微環境中CD8+T淋巴細胞越多，腫瘤腋窩淋巴結轉移率越低。隨著CD8+T淋巴細胞的增多，患者的無瘤生存時間和總生存時間均延長。可見，CD4+及CD8+T 淋巴細胞在乳腺浸潤性導管癌微環境中的表達能有效預測患者的預后。