貝母混合品中川貝母含量近紅外光譜檢測(cè)方法優(yōu)化*

齊明輝，胡雪婷，趙靜，2，李正，2，劉明，李剛

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津 301617；2.省部共建組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192；4.天津大學(xué)精密測(cè)試技術(shù)及儀器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072）

貝母始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因其良好的止咳化痰的療效，在中國應(yīng)用較為廣泛[1-3]，其中川貝母（Fritillariae Cirrhosae，F(xiàn)C） 療效最佳。 浙貝母（Fritillariae Thunbergii，F(xiàn)T）、伊貝母（Fritillariae Pallidiflorae，F(xiàn)P）因與FC外觀相似、顏色差異小，價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于FC，所以市面上將FT、FP摻入川貝母中進(jìn)行銷售的情況屢有發(fā)生[4]，這給制藥企業(yè)原料采購帶來嚴(yán)重的影響。因此，對(duì)貝母樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)顯得尤為必要。

目前對(duì)貝母的質(zhì)量檢測(cè)采用的方法有色譜分析、色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析、形態(tài)學(xué)方法、以及DNA分子標(biāo)記[5]。其中，色譜分析方法是貝母樣品質(zhì)量檢測(cè)的常用方法，也被列入中國藥典作為貝母質(zhì)量檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)也得到廣泛的應(yīng)用[6-7]。如Liu等[8]利用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜為基礎(chǔ)的非目標(biāo)代謝組學(xué)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了不同貝母的特異性標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了貝母品種的鑒別。Luo等[9]結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法和UPLC-ELSD指紋圖譜，采用相似性分析、層次聚類分析和主成分分析的方法，實(shí)現(xiàn)了FC及其混淆品的鑒別。上述方法均獲得了較好的FC質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果，然而這些方法要求操作者技術(shù)熟練且有豐富的經(jīng)驗(yàn)，化學(xué)試劑，分析過程中需要其他化學(xué)試劑的消耗，并且整個(gè)分析時(shí)間較長(zhǎng)，一般用于對(duì)原料藥材的抽檢。不能滿足制藥企業(yè)大批量原料藥材快速質(zhì)量檢測(cè)的要求。

近紅外光譜技術(shù)以其具有快速、無損的分析特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等[10-12]多個(gè)領(lǐng)域。近紅外光譜技術(shù)也被應(yīng)用到貝母的質(zhì)量檢測(cè)中來。如：在掃描次數(shù)、分辨率分別為32、16 cm-1的參數(shù)設(shè)定下，Chen et al[13]利用傅里葉變換近紅外光譜儀（PerkinElmer，MA，USA）采集四種完整顆粒貝母的光譜，快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)了川貝母、浙貝母、伊貝、平貝的品種鑒別。趙耀東等[14]利用傅里葉變換近紅外光譜系統(tǒng)定量檢測(cè)浙貝母中有效成分的實(shí)驗(yàn)中，將掃描次數(shù)設(shè)置為64次，分辨率為8.0 cm-1，增益為1，對(duì)過60目篩的浙貝母粉末采集光譜，結(jié)合偏最小二乘回歸模型，實(shí)現(xiàn)了浙貝母貝母素甲和貝母素乙含量的快速檢測(cè)。Yu等[15]設(shè)置傅里葉近紅外光譜儀器參數(shù)掃描次數(shù)、分辨率分別為32、4 cm-1，建立了一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確鑒別七種不同產(chǎn)地貝母藥材的方法。鄧波等[16]在分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64，增益為自動(dòng)增益的參數(shù)條件下，利用傅里葉變換近紅外光譜儀獲取貝母及其近緣物種的光譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合主成分分析方法，實(shí)現(xiàn)了兩者的鑒別。

由上述研究可見，近紅外光譜技術(shù)為貝母樣品的質(zhì)量檢測(cè)提供了一種快速便捷的檢測(cè)方法。然而該方法在數(shù)據(jù)采集過程中易受到粒徑大小、掃描次數(shù)、分辨率、增益等實(shí)驗(yàn)條件的影響。粒徑大小在已有的相關(guān)研究中，還沒有考慮到對(duì)采集條件進(jìn)行優(yōu)化?？紤]到實(shí)際應(yīng)用中各參數(shù)相互影響，本研究以市面上經(jīng)常出現(xiàn)的FT、FP混入FC進(jìn)行售賣的混合樣品為例，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)貝母粉末近紅外光譜質(zhì)量檢測(cè)中的粒徑大小、掃描次數(shù)、分辨率以及增益4個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究，并在同樣的建模條件和方法下進(jìn)行模型性能比較，為貝母粉末樣品的近紅外光譜質(zhì)量檢測(cè)參數(shù)優(yōu)化提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 樣品準(zhǔn)備 貝母藥材采自四川、浙江、新疆3個(gè)省份，共獲取FC、FT、FP各6批。為避免貝母的含水量差異對(duì)研究造成影響，所有樣品經(jīng)過烘干至恒重，然后進(jìn)行粉碎、混合處理。為提高模型的豐富性，避免單批樣品導(dǎo)致模型的特異性，本研究將6批FC、FT、FP分別混合成3批，針對(duì)混合的純品分別隨機(jī)選出1種，將3種貝母組合，最終得到6種組合（A1、A2、A3、A4、A5、A6）。FC、FT、FP 的混合比例如圖1所示，根據(jù)FC在混合品所占比例（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1），將混合品分為 6 組，從 group0 到group5表示FC比例增大，從左到右FT比例減小，F(xiàn)P比例增大，其中編號(hào)19為FC純品，因此共得到18×6+3=111例混合品樣本。受到采購樣品總量的限制，其中獲得的2個(gè)混合品樣本量較少，不能滿足近紅外光譜數(shù)據(jù)采集要求，因此用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的混合品樣本共109例。

圖1 混合設(shè)計(jì)與分組方法

1.2 近紅外光譜數(shù)據(jù)采集 本研究采用Thermo Electron公司生產(chǎn)的Antaris Ⅱ FT-NIR System傅里葉變換近紅外光譜儀獲取樣品的漫反射光譜。光譜波數(shù)范圍為4 000 cm-1～10 000 cm-1。光譜采集過程中，溫度始終保持在25℃左右，濕度在35%左右。

采集光譜前，基于 DOE（Design of experiment）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)文獻(xiàn)中常用的粒徑大小、掃描次數(shù)、分辨率、增益4個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化組合。選擇L9（34）正交表，3因素3水平的因素水平表如表1所示。

表1 因素水平表

采集9個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的貝母粉末樣品近紅外光譜。在光譜采集過程中，每個(gè)樣品采集3次，取其平均光譜作為樣品光譜，以進(jìn)行下一步分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理 為消除顆粒分布不均勻和顆粒大小產(chǎn)生的散射現(xiàn)象，本研究采用多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）[17-18]進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，從而去除散射影響。偏最小二乘回歸（Partial Least Squares Regression，PLSR）是一種有用的多變量分析方法，廣泛應(yīng)用于自變量（X）與因變量（Y）之間具有大量共線性變量的數(shù)據(jù)。作為經(jīng)典的線性回歸模型，PLSR已被廣泛用于解決農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域的定量預(yù)測(cè)問題。PLSR結(jié)合了主成分分析和多元回歸的特點(diǎn)。它提取了1組潛在因素，并盡可能解釋了自變量和因變量之間的協(xié)方差，在處理共線性變量的數(shù)據(jù)中具有較大的優(yōu)勢(shì)，在處理共線性變量的數(shù)據(jù)中具有較大的優(yōu)勢(shì)。本研究利用PLSR對(duì)劃分的數(shù)據(jù)集進(jìn)行建模分析，并采用決定系數(shù)R2、預(yù)測(cè)集均方根誤差（Root Mean Square Error of Prediction，RMSEP）以及F值對(duì)模型預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，F(xiàn)值計(jì)算公式如下所示，F(xiàn)值越大，表明模型的預(yù)測(cè)能力越好。本研究所有數(shù)據(jù)處理均使用Matlab R2018a軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察 圖2a、b、c、d分別為粒徑大小、掃描次數(shù)、分辨率、增益四個(gè)研究因素對(duì)光譜的考察。研究通過針對(duì)同1個(gè)樣本，改變其他3個(gè)因素，控制一個(gè)因素的方法，以考察單因素對(duì)樣品光譜的影響。圖2a表明，粒徑大小對(duì)樣品光譜的吸光度有影響，隨著粒徑越小，吸光度呈現(xiàn)越小的現(xiàn)象。光譜信噪比大小與掃描次數(shù)有關(guān)，因此，本文對(duì)3水平下4 000～9 000 cm-1波數(shù)范圍的樣品光譜峰谷數(shù)量進(jìn)行比較，以獲得光譜平滑度，來評(píng)估不同掃描次數(shù)的光譜質(zhì)量。其中，峰谷數(shù)量越多，說明光譜波動(dòng)較大，毛刺較多，光譜質(zhì)量低；峰谷數(shù)量越少，光譜越平滑，毛刺少，光譜質(zhì)量高。圖2b為不同掃描次數(shù)峰谷數(shù)量的箱線圖。圖2d直觀地表達(dá)了不同掃描次數(shù)峰谷數(shù)量的差異，掃描次數(shù)少，峰谷數(shù)量多，說明光譜毛刺較多；隨著掃描次數(shù)增多，峰谷數(shù)量減少，光譜越平滑，說明多次掃描平均，能夠有效去除光譜中的部分噪聲，但掃描次數(shù)并不是越多越好，多次測(cè)量平均雖然可以去除部分噪聲，但是在去除噪聲的同時(shí)，也可能去除了部分有用信號(hào)，導(dǎo)致儀器所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差較大。因此選取最佳掃描次數(shù)提高后續(xù)定量模型的預(yù)測(cè)能力顯得非常必要。分辨率反映了不同光程下的樣品信息，增益為信號(hào)增強(qiáng)的程度，圖2c、d分別顯示了不同水平分辨率與增益的樣品光譜，右上角分別顯示了不同水平分辨率與增益的光譜，從圖中發(fā)現(xiàn)，不同水平分辨率和增益的光譜彼此重疊，吸光度沒有明顯差異。利用三維光譜圖考察了不同水平分辨率和增益的光譜噪聲，從圖中發(fā)現(xiàn)，依據(jù)光譜噪聲也不能選出最佳水平。因此，單因素考察不能得出有效結(jié)論。

圖2 不同影響因素的光譜

2.2 不同因子水平組合下貝母樣品的近紅外光譜 3種純品貝母的光譜特征及九組不同因子水平組合下109例樣本的平均近紅外光譜曲線如圖3所示。

圖3 九種不同因子水平組合的MSC光譜

由圖3可見，9個(gè)組合下各光譜曲線的波形無明顯差異，均存在6個(gè)吸收峰，分別位于4 200 cm-1、4600cm-1、5600cm-1、6300cm-1、6900cm-1、8300cm-1，這與C-H、O-H、N-H的伸縮與倍頻振動(dòng)相關(guān)[19]。進(jìn)一步對(duì)九組不同因子水平光譜吸光度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，各組間吸光度存在差異，但與文獻(xiàn)中已證明的粒徑越小，吸光度越小[20]結(jié)論不同，表明掃描次數(shù)、分辨率、增益對(duì)吸光度也有一定的影響，同時(shí)進(jìn)一步證明參數(shù)之間相互影響，基于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化研究是有必要的。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由于模型性能涉及到多種指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)在保證模型未過擬合的情況下，綜合考慮R2、RMSEP對(duì)建模效果及模型預(yù)測(cè)能力的影響，因此采用F值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)?；赑LSR模型的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。其中R值反映了同一影響因素不同水平所建模型預(yù)測(cè)能力的模型差異，R值越大，表明同一因素不同水平的影響越顯著。K值反映了同一影響因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響，K值越大，該水平對(duì)應(yīng)該因素的影響越大，K值最大是因素水平為該影響因素的優(yōu)水平。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2的極值 R 來看，RC＞RA＞RB＞RD，由此可見影響貝母粉末樣品中FC含量定量模型預(yù)測(cè)精度的主次因素為掃描次數(shù)＞粒徑＞分辨率＞增益。

嚴(yán)衍祿[22]提到：“掃描次數(shù)增加，相應(yīng)模型的性能有所改善，這是因?yàn)閽呙璐螖?shù)增加提高了光譜的信噪比，但不是掃描次數(shù)越多越好”。本研究中，C3為優(yōu)水平，即掃描次數(shù)為64時(shí)，模型較好。進(jìn)一步對(duì)正交試驗(yàn)K值結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)于掃描次數(shù)，K1＜K2＜K3，表明掃描次數(shù)越大，模型越優(yōu)，然而掃描次數(shù)與模型性能是否呈現(xiàn)線性還有待研究。

粒徑大小反映了樣品對(duì)光譜散射影響，有研究[20]表明粒徑越小，光譜質(zhì)量越高，本研究中過120目藥典篩的樣品粒徑為該影響因素的優(yōu)水平，其中K2＜K1＜K3，與已有結(jié)論存在差異，這可能是因?yàn)?4個(gè)參數(shù)之間相互影響的結(jié)果。

傅里葉變換近紅外光譜儀的分辨率與移動(dòng)反光鏡的移動(dòng)距離有關(guān)[23]，分辨率越高，波數(shù)點(diǎn)越多，光譜數(shù)據(jù)越豐富；對(duì)于對(duì)光譜有較強(qiáng)吸收的樣品來說，可以獲取樣品更多光譜特征信息；對(duì)于吸收較弱的樣品來說，造成光譜數(shù)據(jù)冗余，有效光譜數(shù)據(jù)比例降低，從而導(dǎo)致模型較差[24]。本研究將4 cm-1、8 cm-1、16 cm-13個(gè)水平的分辨率引入正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，其中最佳模型對(duì)應(yīng)的分辨率為介于3個(gè)水平的中間值，表明分辨率為8 cm-1時(shí)，川貝母及其摻假品有較好的吸收，同時(shí)避免了數(shù)據(jù)冗余對(duì)數(shù)據(jù)處理的影響。

系統(tǒng)信號(hào)的增強(qiáng)程度用增益表示，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了2、4、8三個(gè)水平的增益，其中增益為8時(shí)，模型最佳。

由表2可見，九個(gè)不同參數(shù)組合下的F值范圍為69.07-88.11。F值反映了不同因素的最優(yōu)水平組合，F(xiàn)值越大，模型預(yù)測(cè)性能越好，因此正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最佳組合是A3B2C3D1。K值反映了同一影響因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響，K值越大，該水平對(duì)應(yīng)該影響因素的優(yōu)水平，因此四個(gè)影響因素的最佳優(yōu)水平組合為A3B2C3D3。A3B2C3D3并沒有出現(xiàn)于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中。為了確定最優(yōu)參數(shù)組合，分別對(duì)A3B2C3D1、A3B2C3D3兩種參數(shù)組合下獲得的模型預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。圖4a、b為A3B2C3D1、A3B2C3D3對(duì)應(yīng)的PLSR模型預(yù)測(cè)結(jié)果。圖4c為兩參數(shù)組合所建模型性能指標(biāo)參數(shù)。其中數(shù)值1代表A3B2C3D1參數(shù)組合，2代表A3B2C3D3參數(shù)組合。圖4c直觀地反映了A3B2C3D3的模型預(yù)測(cè)性能整體優(yōu)于A3B2C3D1。結(jié)果表明，A3B2C3D3即粒徑為過120目藥典篩、掃描次數(shù)為64、分辨率為8，增益為8，此時(shí)建模結(jié)果為：Rp2=0.9742，RMSEP=0.0438，F(xiàn)=93.33。

圖4 不同參數(shù)組合PLSR模型預(yù)測(cè)結(jié)果

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，合理的參數(shù)設(shè)計(jì)可以最大程度地提高模型的可靠性和預(yù)測(cè)能力。掃描次數(shù)、粒徑大小、分辨率以及增益4個(gè)因素對(duì)模型預(yù)測(cè)精度均有一定的影響，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以綜合考慮各因素的共同影響，獲取最優(yōu)參數(shù)組合。

3 總結(jié)

近紅外光譜檢測(cè)參數(shù)的選擇直接影響模型的預(yù)測(cè)能力。本研究以市面上常見的FC中摻入FT和FP的貝母樣品為例，對(duì)貝母粉末中FC含量的近紅外光譜定量檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，為避免對(duì)模型單因素影響研究的局限性，本研究通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合評(píng)價(jià)粒徑大小、掃描次數(shù)、分辨率、增益多因素對(duì)模型的共同影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)參數(shù)均會(huì)給貝母粉末近紅外光譜定量分析模型精度帶來影響。并且貝母粉末粒徑大小為120目，掃描次數(shù)為64，分辨率為8，以及增益為8時(shí)，可以建立最優(yōu)模型，獲得最佳的檢測(cè)結(jié)果。該方法綜合考慮了近紅外光譜數(shù)據(jù)采集中的4個(gè)重要參數(shù)的不同水平組合，有效的避免了單因素研究的局限性，本研究為制藥企業(yè)中貝母粉末樣品近紅外光譜質(zhì)量檢測(cè)參數(shù)優(yōu)化提供了借鑒。