清感冬飲通過調控NF-κB/iNOS/NO信號通路抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥*

蘇瑞，盧佳，席智男，王佳寶，宋新波，張晗，苗琳

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學方劑學教育部重點實驗室，天津301617；3.天津中醫(yī)藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；4.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；5.天津現代創(chuàng)新中藥科技有限公司，天津 300392）

清感冬飲是張伯禮院士根據多年臨證經驗擬定的復方制劑，方中黃芪和虎杖為君藥，炒牛蒡子、金銀花、紫蘇葉、射干和桔梗為臣藥，赤芍和山楂為佐藥，甘草為使藥，紅茶為基質，共奏益氣固表、清熱解毒、清咽利喉、宣肺止咳的功效。清感冬飲主治外感風寒，陽氣不足證，臨床上用于冬季發(fā)作的急慢性咽喉炎、急慢性鼻炎和急慢性支氣管炎等呼吸道疾病。

炎癥是機體的先天免疫系統(tǒng)針對內源性或外源性刺激產生的一種自我防御反應[1]。多種呼吸道疾病的病理進程中伴隨有炎癥的產生[2]，抑制炎癥的惡性發(fā)展對于治療疾病尤為重要。課題組前期研究表明清感冬飲可降低急性咽炎大鼠血清中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量，但其抗炎機制尚不明確。巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的第一道防線，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展和消退中表現豐富的生物學功能[3]。故本研究采用研究炎癥性疾病最常用的體外炎癥模型，即脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，探究清感冬飲對細胞炎癥的影響及其潛在的分子機制[4]。

1 材料

1.1 細胞 HEK293T細胞由南開大學藥學院白鋼教授和姜民老師所在實驗室提供；小鼠RAW264.7巨噬細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 藥品 清感冬飲，功效：益氣固表、清熱解毒、清咽利喉、宣肺止咳。由天津中醫(yī)藥大學現代中藥創(chuàng)新中心提供，批號：KG20200219-3。

1.3 儀器 TECAN酶標儀（北京海天友誠科技有限公司）；Thermo CO2細胞培養(yǎng)箱、Thermo Fisher高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Multilabel Plate Reader功能讀板儀（美國Perkins Elmer公司）；Nikon倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；NanoPhotometer N60 Touch超微量分光光度計（德國IMPLEN公司）；T100梯度PCR儀（美國BioRAD公司）；實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；智能活細胞成像分析儀（美國BioTek公司）；全能型成像系統(tǒng)（美國BioRAD公司）。

1.4 試劑 DMEM高糖型培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素-鏈霉素（以色列Biological Industries生物科技公司）；螢火蟲熒光素酶 報 告 基 因 載 體（pGL4.37、pGL4.32、pGL4.75）、Dual-Luciferase檢測系統(tǒng)（美國Promega公司）；脂多糖（美國Sigma公司）；CCK-8和LDH檢測試劑盒（日本同仁化學研究所）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒、Hoechst 33258染色液、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒和抗熒光淬滅劑（上海碧云天生物技術有限公司）；ELISA試劑盒[TNF-α、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-1β（IL-1β）]、胰蛋白酶和TRIzol試劑（美國Invitrogen生命技術有限公司）；叔丁基對苯二酚（tBHQ）和地塞米松（Dex，美國MedChemExpress公司）；TNF-α（美國 PeproTech公司）；聚乙烯亞胺（PEI，美國 Polysciences公司）；High Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒和一氧化氮合酶（iNOS）抗體（美國Thermo Fisher Scientific公司）；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox，瑞士Roche公司）；三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（美國 Affinity公司）；核因子-κB p65（p65）抗體（美國CST公司）；核纖層蛋白B1（LaminB1）抗體（美國Abcam公司）。

2 方法

2.1 HEK293T細胞培養(yǎng) HEK293T細胞使用DMEM高糖型培養(yǎng)基（含體積分數為1%青霉素-鏈霉素和體積分數為10% FBS）于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長至對數生長期以0.25%胰酶進行消化傳代并開展實驗。

2.2 RAW264.7巨噬細胞培養(yǎng) RAW264.7巨噬細胞用含體積分數10% FBS的DMEM高糖型培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長至對數生長期進行傳代與實驗。

2.3 清感冬飲的準備 將黃芪（3 g）、虎杖（3 g）、牛蒡子（3 g）、射干（2 g）、桔梗（2 g）、赤芍（2 g）、紫蘇葉（2 g）、金銀花（3 g）、山楂（1枚）和甘草（1 g）混合，加入10倍量蒸餾水，浸泡40 min，煮沸，過濾，重復上述步驟，合并兩次所得濾液，于60℃以下濃縮，使其糖度為15～17 Brix，噴霧干燥，于干燥罐中儲存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取清感冬飲50 mg溶于1 mL滅菌超純水中，超聲處理30 min后，過0.22 μm無菌濾膜，得50 mg/mL清感冬飲溶液，用DMEM培養(yǎng)基將其稀釋為 100、10、1、0.1、0.01 μg/mL 目標溶液。

2.4 細胞活力檢測 分別取對數生長期的HEK293T細胞和RAW264.7巨噬細胞，以2×105個/mL密度接種于96孔板，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去96 孔板內原有培養(yǎng)基，給藥組加入 0.01、0.1、1、10、100 μg/mL的清感冬飲，對照組加入DMEM高糖型培養(yǎng)基，100 μL/孔。培養(yǎng)一定時間后，吸取上清液置于新的96孔板中，按LDH試劑盒說明書操作，孵育15 min后于490 nm處測定吸光度。原96孔板按CCK-8試劑盒說明書操作，孵育一定時間后于450 nm處檢測吸光度。兩種方法均以空白對照組為基準，計算清感冬飲給藥組LDH漏出量和細胞活力的百分率。每組6個復孔，重復3次。

2.5 清感冬飲對ARE、NF-κB轉錄活性的影響

2.5.1 HEK293T細胞瞬時共轉染 取對數生長期的HEK293T細胞，以2×105個/mL的密度接種于96孔板，待細胞生長密度達到70%～80%時，使用1 mg/mL PEI轉染試劑轉染ARE（pGL4.37）或 NF-κB 熒光素酶報告質粒（pGL4.32），100 ng/孔，同時加入海腎熒光素酶報告質粒（pGL4.75），10 ng/孔，培養(yǎng) 24 h。

2.5.2 基于雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測HEK293T細胞抗氧化反應元件（ARE）和核因子-κB（NF-κB）轉錄活性 對于轉染ARE熒光素酶報告質粒的細胞，給藥分組設置為：空白對照組、10 μmol/L tBHQ陽性藥組、清感冬飲安全濃度給藥組；對于轉染NF-κB熒光素酶報告質粒的細胞，給藥分組設置為：空白對照組、10 ng/mL TNF-α 模型組、10 μmol/L 地塞米松陽性藥組、清感冬飲安全濃度給藥組。均培養(yǎng)6 h后棄上清液，PBS洗滌細胞2次，100 μL/孔，加入細胞裂解液裂解細胞，按照Dual-Luciferase檢測系統(tǒng)說明書檢測熒光強度，并計算相對熒光素酶活性值（相對熒光比率（L/S）=Luciferase活性值/Renilla活性值）。每組實驗設置6個復孔，重復3次。

2.6 建立LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型 RAW264.7巨噬細胞以2×105個/mL密度接種于96孔板，24 h后分組處理細胞。模型組加入終濃度為1 μg/mL LPS；清感冬飲給藥組細胞用終濃度為 1μg/mLLPS 與終濃度為 0.01、0.1、1、10、100μg/mL清感冬飲共處理24 h，100 μL/孔，空白對照組加入等體積的DMEM高糖型培養(yǎng)基。

2.7 Griess法檢測RAW264.7巨噬細胞NO釋放量 收集對數生長期的RAW264.7巨噬細胞，按2×105個/mL密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。給藥分組設置同“2.6”項，每個濃度6個復孔。加藥處理24 h，收集各組細胞培養(yǎng)液上清進行NO釋放量檢測。以濃度為 0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L 的標準品繪制標準曲線。在96孔板中依次加入標準品及樣品、Griess Reagent I、Griess Reagent Ⅱ，各 50 μL/孔，540 nm處測定吸光度。根據標準品曲線計算樣品中NO濃度。

2.8 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β釋放量 收集對數生長期的RAW264.7巨噬細胞，按2×105個/mL密度接種于96孔板。實驗分組同“2.6”項，每個濃度3個復孔。給藥24 h后離心，收集各組細胞培養(yǎng)液上清，按ELISA試劑盒說明書檢測上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度。

2.9 qRT-PCR 法檢測 TNF-α、IL-6 和 IL-1β mRNA的表達 收集對數生長期的RAW264.7巨噬細胞，按1.5×105個/mL密度接種于60 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h。給藥分組設置為空白對照組（Control）、LPS、1、10、100 μg/mL 清感冬飲組，每個濃度 3 個復孔。加藥處理24 h后，使用Trizol試劑從各組細胞中提取總RNA。樣品的RNA濃度及純度通過NanoPhotometer N60Touch超微量分光光度計測定。按照High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit說明書將總RNA逆轉錄為cDNA，反應條件為25℃，10 min；37℃，120 min；85℃，5 min；4℃，Hold。以 cDNA 為模板，使用 FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）和目標引物，見表1，進行目的基因擴增，擴增程序為50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，45 cycles。以GAPDH為內參，GAPDH引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。使用2-ΔΔCT法計算mRNA表達水平，以目的基因的相對表達量做圖。

表1 引物序列

2.10 免疫熒光法評估p65轉錄入核情況 將細胞爬片玻片置于24孔板中，收集對數生長期的RAW264.7巨噬細胞，按6×104個/mL密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h。實驗分組設置同“2.9”項。給藥24 h后，對各組細胞依次進行如下處理：預冷的PBS清洗細胞3次、4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min、0.3% TritionX-100 室溫通透 30 min、5%山羊血清 37℃封閉 30 min、p65（1∶200）一抗 4℃孵育過夜、二抗（1∶1 000）37 ℃避光孵育 1 h、Hoechst 33258室溫染核10 min、抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察p65的定位及表達情況并拍照。Image J軟件分析圖片，計算平均熒光強度。

2.11 Western bolt法檢測RAW264.7巨噬細胞中p65和iNOS蛋白表達水平 收集對數生長期的RAW264.7巨噬細胞，按2.5×105個/mL密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h。實驗分組設置同“2.9”項。按照細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書和細胞總蛋白抽提流程提取各組細胞蛋白。采用BCA法測定蛋白質濃度并進行定量變性。蛋白樣品經10% SDS-PAGE分離后，轉移到0.45 μmPVDF膜上，在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，隨后將PVDF膜與一抗（p65、iNOS、GAPDH 和 Lamin B1）4°C 孵育過夜，用對應的二抗室溫孵育1 h后顯影。利用Image J軟件對條帶進行灰度值分析，以GAPDH與Lamin B1為內參，計算目標蛋白的相對表達量。

2.12 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數據用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。應用GraphPad Prism 5.0軟件進行繪圖。

3 結果

3.1 清感冬飲對HEK293T細胞的安全作用濃度篩選 不同濃度的清感冬飲處理HEK293T細胞6 h后，0.01～10 μg/mL清感冬飲組HEK293T細胞活力和LDH漏出量與空白對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），100 μg/mL 清感冬飲對 HEK293T 細胞生長有抑制作用（P＜0.01），故采用 0.01～10 μg/mL 清感冬飲探討其抗氧化、抗炎作用，見圖1。

圖1 QGDY對HEK293T細胞活力（a）及LDH漏出量（b）的影響（±s，n=18）

3.2 清感冬飲對RAW264.7巨噬細胞的安全作用濃度篩選 0.01～100 μg/mL清感冬飲處理RAW264.7巨噬細胞24 h后，細胞存活率均大于95%。與空白對照組相比，10～100 μg/mL清感冬飲使細胞活力顯著上升，1～100 μg/mL清感冬飲使LDH 漏出量顯著降低（P＜0.01，P＜0.001），表明 0.01～100 μg/mL清感冬飲干預24 h對RAW264.7無細胞毒性作用，見圖2。采用藥物的安全濃度探討清感冬飲的抗炎作用。

圖2 QGDY對RAW264.7巨噬細胞活力（a）及LDH漏出量（b）的影響（±s，n=18）

3.3 清感冬飲對ARE轉錄基因活性的影響 與空白對照組相比，tBHQ陽性藥組ARE的表達顯著升高（P＜0.001）。0.01、0.1、1、10、100 μg/mL 清感冬飲組ARE表達水平相較于空白對照組無統(tǒng)計學差異，表明清感冬飲無明顯抗氧化活性，見圖3。

圖3 QGDY對HEK293T細胞ARE熒光素酶活性的影響（±s，n=18）

3.4 清感冬飲對NF-κB轉錄基因活性的影響 與空白對照組比較，HEK293T細胞經TNF-α誘導后NF-κB 的表達顯著升高（P＜0.001），表明 NF-κB 雙熒光素酶報告系統(tǒng)構建成功。與TNF-α模型組相比，陽性藥地塞米松給藥濃度為10 μmol/L時能顯著抑制 NF-κB 的表達（P＜0.001），1～10 μg/mL 清感冬飲能顯著抑制TNF-α誘導的NF-κB啟動子的活性（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

圖4 QGDY對HEK293T細胞NF-κB啟動子熒光素酶活性的影響（±s，n=18）

3.5 清感冬飲對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞形態(tài)變化的影響 正常情況下，RAW264.7巨噬細胞呈現輪廓清晰的圓形或橢圓形。如圖5所示，經LPS刺激后，與空白對照組相比，細胞伸出偽足，變?yōu)樗笮位蚨噙呅危w積增大，包膜變暗，細胞質中溶酶體顆粒和液泡數量增加，細胞核突出。當清感冬飲的給藥濃度達到1 μg/mL及其以上時，由LPS刺激誘發(fā)的形態(tài)異常得到不同程度的改善，具體表現為細胞形態(tài)趨近于類圓形，包膜變亮，細胞質中溶酶體顆粒和液泡數量明顯減少，體積縮小。

圖5 QGDY對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞形態(tài)變化的影響（20×）

3.6 清感冬飲對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞NO釋放量的影響 與空白對照組比較，模型組的RAW264.7巨噬細胞經LPS誘導后NO釋放量顯著升高（P＜0.001），表明該細胞炎癥模型構建成功。與LPS模型組比較，1～100 μg/mL清感冬飲能呈劑量依賴性顯著抑制 NO 釋放 （P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），見圖6。

圖6 QGDY對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞NO釋放量的影響（±s，n=18）

3.7 清感冬飲對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6和IL-1β釋放量的影響 空白對照組細胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量均較低，經LPS刺激后，模型組TNF-α、IL-6和IL-1β釋放量均顯著增加（P＜0.001）。與LPS模型組比較，1～100 μg/mL 清感冬飲干預組的 TNF-α、IL-6 和IL-1β 釋放量顯著降低（P＜0.01，P＜0.001），且呈現劑量依賴性，見圖7。

圖7 QGDY對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞TNF-α（a）、IL-6（b）和 IL-1β（c）釋放量的影響（±s，n=9）

3.8 清感冬飲對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達水平的影響 通過qRT-PCR檢測各組細胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達水平。如圖8所示，與空白對照組相比，LPS顯著增加促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達（P＜0.001）。與LPS模型組相比，10～100 μg/mL清感冬飲可明顯抑制 LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中 TNF-α、IL-6和 IL-1β mRNA表達（P＜0.05，P＜0.001）。

圖8 QGDY 對 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞 TNF-α（a）、IL-6（b）和 IL-1β（c）mRNA 表達水平的影響（±s，n=9）

3.9 清感冬飲對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中p65核移位的影響 通常，p65（紅色熒光）主要定位于細胞胞漿中。當細胞經1 μg/mL LPS刺激后，細胞核區(qū)可見明顯的紅色熒光（P＜0.001），表明LPS促使p65從胞漿移位入核。與LPS模型組相比，10～100 μg/mL清感冬飲使細胞核內p65平均熒光強度減弱，顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中p65 核移位（P＜0.01，P＜0.001），見圖9。

圖9 QGDY對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中p65核移位的影響（40×）（±s，n=6）

3.10 清感冬飲對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中p65和iNOS蛋白水平的影響 Western blot結果顯示，1 μg/mL LPS作用于RAW264.7巨噬細胞后，可顯著抑制細胞漿中p65蛋白表達（P＜0.05），顯著上調細胞核中p65蛋白與iNOS總蛋白的表達（P＜0.01）。與LPS模型組比較，100 μg/mL清感冬飲顯著升高細胞漿中p65蛋白的表達（P＜0.01），顯著降低 iNOS 蛋白的表達（P＜0.05），10～100 μg/mL 清感冬飲顯著降低細胞核中p65蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.001）。

圖10 QGDY 對 LPS 誘導的 RAW264.7巨噬細胞 NF-κB p65（a和 b）和 iNOS（c）蛋白表達水平的影響（±s，n=3）

4 討論

炎癥是機體由內部或外部刺激誘發(fā)的復雜生物過程，參與多種疾病的病理進程[5]。NF-κB信號通路已被充分證明是重要的促炎信號通路之一[6]。炎癥反應和氧化應激之間存在密切聯(lián)系，炎癥會誘發(fā)氧化應激的發(fā)生[7]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）/核轉錄因子 E2 相關因子 2（Nrf2）/ARE 信號通路作為氧化應激的生物反應中心，調節(jié)許多抗氧化基因的轉錄[7]。基于上述事實，采用了增殖快、較易培養(yǎng)、轉染效率高的HEK293T細胞[8]，分別建立ARE和NF-κB雙熒光素酶報告系統(tǒng)，初步確定清感冬飲具有抗炎活性，而無明顯抗氧化活性。

巨噬細胞是免疫反應的效應細胞，參與炎癥反應的多個環(huán)節(jié)。RAW264.7是小鼠腹腔單核巨噬細胞，是一種廣泛應用于炎癥研究的體外巨噬細胞系[9]。LPS誘導RAW264.7巨噬細胞炎癥模型是研究炎癥性疾病和篩選抗炎活性物質最常用的體外炎癥模型[4]。LPS也稱為內毒素，是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組成部分，可被模式識別受體（PRR）識別，如 Toll樣受體 4（TLR4）[10]。LPS與巨噬細胞膜表面的TLR4結合，激活轉錄因子，例如NF-κB，進而釋放炎癥介質 NO、TNF-α、IL-6和IL-1β等，從而加速炎癥性疾病的發(fā)展[11]。清感冬飲能否作用于NF-κB抑制巨噬細胞炎癥介質釋放成為后續(xù)的研究重點。

iNOS是在細菌產物（如LPS）刺激宿主時催化L-精氨酸（L-Arg）產生NO的關鍵酶，NO過量產生會引起急性和慢性炎癥，導致細胞死亡、組織損傷等病理變化[12-13]。因此，調節(jié)iNOS基因的表達是治療涉及NO參與的炎癥性疾病最直接、最關鍵的方式。本研究發(fā)現，清感冬飲可以顯著減少LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中NO的過量產生，表明清感冬飲通過抑制NO的產生來抑制炎癥。進一步研究發(fā)現，清感冬飲通過顯著抑制iNOS的表達來抑制NO過量產生。

iNOS基因的啟動子包括NF-κB、激活蛋白-1（AP-1）及信號轉導和轉錄激活因子1（STAT-1）等識別位點[13]。巨噬細胞中NF-κB的活化可使iNOS的表達水平明顯增加，導致NO釋放量持續(xù)升高，進而使得巨噬細胞分泌促炎細胞因子TNF-α[14]。TNF-α可以調節(jié)炎性細胞因子級聯(lián)反應以刺激其他促炎細胞因子的釋放，例如IL-6和IL-1β[15]。IL-6和IL-1β在先天性和適應性免疫反應中起重要作用，機體適量的分泌IL-6和IL-1β有助于感染的恢復，但其過度積累會使炎性損傷級聯(lián)效應放大，進一步加劇炎癥反應，形成惡行循環(huán)[16-17]。因此，調節(jié)促炎細胞因子的產生被認為是控制炎癥性疾病惡化的一種有效策略。ELISA實驗結果顯示，與對照組相比，RAW264.7巨噬細胞經LPS誘導后TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放量顯著增加，而清感冬飲顯著抑制了LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的產生，且呈劑量依賴性。為了進一步驗證上述結果，筆者對TNF-α、IL-6和IL-1β進行了qRT-PCR分析。發(fā)現清感冬飲顯著下調LPS處理后TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達水平，在細胞轉錄水平顯示出清感冬飲的抗炎活性。

NF-κB是一種轉錄因子，在調節(jié)與免疫和炎癥反應相關的基因表達中起重要作用。正常情況下，NF-κB在細胞質中與（核因子-κB 抑制蛋白）IκB結合形成復合物，以非活性形式存在[18]。當LPS與巨噬細胞膜上的TLRs結合時，NF-κB信號會響應LPS的刺激而被激活，核因子-κB抑制蛋白激酶α（IKK）使IκBα磷酸化，磷酸化的IκBα被泛素化并隨后被26S蛋白酶體降解，NF-κB移位到細胞核[19]。在細胞核中，p65和p50兩個亞基（尤其是p65）與靶基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列結合并調節(jié)相關基因的轉錄[20]。在本研究中，采用免疫熒光法對p65亞基進行定位，采用蛋白免疫印跡法測定NF-κB信號通路相關蛋白表達情況。得出如下結論：清感冬飲顯著抑制活化巨噬細胞中的p65移位，并下調細胞核內p65蛋白表達水平。

綜上所述，本研究表明清感冬飲通過抑制NF-κB/iNOS/NO信號通路的激活，抑制促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的過度分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。本實驗從細胞水平探討了清感冬飲的抗炎作用機制，為清感冬飲在臨床上進一步推廣應用提供實驗依據。后續(xù)課題組將通過在體實驗深入研究清感冬飲的抗炎機制，并明確清感冬飲的抗炎活性成分。