鋅指E 盒結合同源盒1 通過抑制sirtuin3 影響結腸癌細胞能量代謝和轉移復發的機制

嚴冰冰 吳華星 韓嘉晟 袁勝春*

結腸癌是一種消化道惡性腫瘤，其發病率在全球腫瘤中排第三位，已成為腫瘤中的第二大死亡原因。盡管在結腸癌的診斷和治療方面已取得重大進展，但該疾病的5 年生存率仍保持在6%左右[1]。目前，臨床上治療結腸癌的方法以手術切除、化療、放療為主，但這些方法不足以完全跟治結腸癌[2]，因此，在基因層面探究結腸癌的發病機制以進一步找尋生物療法至關重要。

上皮-間質轉化（EMT）是一種形態學上的細胞程序，其定義為從上皮狀態到間充質狀態的表型轉化。上皮狀態被認為是穩定的并且能夠定殖，而間充質表型被認為是亞穩態的。長期以來，EMT 一直被認為是導致癌細胞轉移的重要因素[3]。EMT 由涉及表觀遺傳修飾和轉錄控制的復雜調控網絡調控[4]。鋅指E 盒結合的同源盒蛋白1（ZEB1）是EMT 的重要調節劑，在調節惡性腫瘤轉移方面起著至關重要的作用[5]。ZEB1 還參與結腸癌細胞基質相關特性的調節。此外，據報道ZEB1 可以調節結腸癌的遺傳毒性反應和耐藥性，并且是改善化療耐藥性的重要目標。ZEB1 是維持結腸癌細胞惡性特性的重要因素。

近年來，異常的癌細胞代謝在腫瘤發生和癌癥進展中的功能受到越來越多的關注[6]。實體瘤細胞位于微環境中，其特征是致密的基質和有限的血管系統，導致嚴重的缺氧狀況。為了在如此惡劣的環境下生存，癌細胞必須改變其代謝模式[7]。通過改變其代謝程序，癌細胞可以使用有限的氧氣和營養供應來滿足不受控制的增殖和轉移需求。與正常細胞獲取能量的方式不同，癌細胞依靠糖酵解途徑。從三磷酸腺苷（ATP）的產生方面來看，效率并不高，但通過糖酵解，癌細胞將葡萄糖分解為小分子，以合成其他大分子[8]。此外，糖酵解產生的乳酸產生了酸性微環境，導致細胞外基質破壞，從而提供了轉移優勢[9]。糖酵解是通過一系列酶促反應將葡萄糖降解成丙酮酸并伴有ATP 生成的過程，一些糖酵解酶如乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶在癌細胞轉移和EMT 中起著至關重要的作用[10-11]。然而，很少報道EMT 調節劑對糖酵解的影響。

SIRT3 是一種腫瘤抑制因子，定位于線粒體，具有很強的脫乙酰酶活性，可通過多種途徑抑制糖酵解。SIRT3 會脫乙酰化并激活與氧化應激有關的細胞反應中涉及的幾種酶，以及調節線粒體代謝的酶，例如異檸檬酸脫氫酶（IDH）或線粒體呼吸鏈復合物。最近的研究表明，SIRT3 在調節線粒體的數量和質量方面也起著至關重要的作用，間接影響與線粒體穩態有關的基因，例如PGC-1α、TFAM 或與線粒體動力學相關的蛋白質[12]。先前研究表明，SIRT3 沉默可增加機體氧化應激反應并導致線粒體功能障礙，使乳腺癌和結腸癌細胞對細胞毒性治療敏感[13-14]。本研究就ZEB1 通過抑制sirtuin3 影響結腸癌細胞能量代謝和轉移復發的機制進行分析。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人結腸癌細胞系SW620 獲自美國典型培養物保藏中心。在含有胎牛血清（FBS）的Dulbecco 改良版Eagle 培養基（DMEM）中培養SW620 細胞，最終濃度為10%。

1.2 穩定的敲低細胞系的產生

為了沉默結腸癌細胞中ZEB1 的表達，使用pLKO.1 TRC 克隆載體（Addgene plasmid 10878）[15]針對ZEB1 目標基因進行轉染（21 bp，正向：5’-CCTCTCTGAAAAA AGAACACATTA-3’，反向：5’-GCTGTTGTTCTGCCAACAGTT-3’）。通過慢病毒包裝載體psPAX2 和pMD2.G 以4∶3∶1 的比例共同轉染pLKO.1-ZEB1 構建體來產生慢病毒顆粒。通過用慢病毒感染靶細胞，然后選擇嘌呤霉素來產生穩定的細胞系。通過實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白質印跡法測量沉默效率。

1.3 RT-PCR

使用TRIzol 試劑（Invitrogen）提取RNA，并使用PrimeScript RT 試劑盒（TaKaRa）進行反轉錄獲得cDNA。通過RT-PCR 確定指定基因和內參基因β-actin 的表達狀態。所有反應重復3 次。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.4 蛋白質印跡法

結腸癌細胞用冰冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌兩次，并在RIPA 緩沖液中裂解10 min，然后超聲處理以確保完全裂解。在4 ℃下，10 000 g 離心20 min去除細胞碎片。將全細胞裂解液（20 μg）在十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液中進行變性，然后進行SDS-PAGE，分離膠濃度為10%。將樣品轉移到膜上，隨后用特異性抗體進行蛋白印跡。ZEB1、SIRT3 和β-actin 抗體購自北京索萊寶科技有限公司。

1.5 細胞外酸化和耗氧率測量

為了評估ZEB1 對結腸癌細胞的糖酵解能力和線粒體呼吸的影響，按照Seahorse XF 糖酵解壓力測試試劑盒和Cell Mito 壓力測試試劑盒的說明，使用Seahorse Bioscience XF96 細胞外通量分析儀測量細胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR），以分析細胞代謝變化。

1.6 活性氧（ROS）產生分析

為了評估ZEB1 和SIRT3 對結腸癌細胞中ROS產生的影響，使用了Beyotime 活性氧檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。使用可滲透細胞的熒光探針2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCF-DA）標記活細胞內的ROS。DCF-DA 擴散到細胞中后，通過細胞酯酶將其脫乙酰基化為非熒光化合物，并被ROS 迅速氧化為DCF。DCF 具有高度熒光性，可以通過細胞儀檢測。熒光強度與細胞內的ROS 水平正比。

1.7 線粒體膜電位測量

使用帶有JC-1 染料的線粒體膜電位測定試劑盒（Beyotime）測量細胞膜電位。JC-1 在線粒體中顯示出電位依賴性積累，在正常線粒體的基質中可以聚集，在膜電位降低的線粒體中則無法聚集，JC-1單體發出綠色熒光（529 nm），JC-1 聚合物發出紅色熒光（590 nm），通過紅色/綠色熒光強度比率可以反映線粒體膜電位。

1.8 雙重熒光素酶測定

為了評估ZEB1 對SIRT3 啟動子活性的影響，使用了雙熒光素酶檢測試劑盒（Promega）。從SW620細胞的基因組DNA 中擴增SIRT3 啟動子，并連接到pGL3-Basic 載體中以產生pGL3-SIRT3 構建體。用海腎熒光素酶載體將pGL3-SIRT3 轉染到結腸癌細胞中。用雙熒光素酶測定試劑盒評估ZEB1 對SIRT3啟動子活性的影響。

1.9 芯片分析

為了測試ZEB1 是否占據了SIRT3 啟動子區域，進行了染色質免疫沉淀（ChIP）分析。使用甲醛處理細胞，使蛋白質與DNA 交聯；之后使用超聲波將染色質打斷為一定大小；通過抗體沉淀蛋白-DNA交聯復合體；解除交聯，純化DNA，用PCR 實時定量檢測DNA 含量。ChIP 分析是使用EZ ChIP 試劑盒（Millipore）和 ZEB1 抗體（Cell Signaling Technologies）進行的。用于檢測與ZEB1 結合的SIRT3 啟動子的引物序列為正向：5'-AGTAGCAGGG ATTACAG GCATGAG-3'，反向：5'-TGCCTTCCCT GAGATACTCAGCT-3'。

1.10 免疫組織化學分析

通過免疫組織化學染色評估結腸癌患者樣品中ZEB1 和SIRT3 的表達。將石蠟切片在70 ℃下孵育1 h，在二甲苯中脫蠟，然后在梯度乙醇中再水化。用3% H2O2將載玻片孵育30 min。在95 ℃的恒溫箱中用檸檬酸緩沖液（pH6.0）處理抗原。抗原回收后，將載玻片與一抗和二抗孵育。以1∶100 的稀釋度使用ZEB1 抗體（Abcam），以1∶50 的稀釋度使用SIRT3 抗體（Abcam）。將切片用3，3-二氨基聯苯胺染色，在PBS 中終止，并用蘇木精復染。

1.11 統計學分析

使用獨立的學生t檢驗（兩尾）或單向方差分析在SPSS 17.0 版（IBM Corp.）中進行統計分析。使用Logistic 回歸確定TCGA 隊列中ZEB1 和SIRT3表達水平之間的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZEB1 在結腸癌中介導有氧糖酵解

蛋白質印跡法結果顯示，shZEB1A 和shZEB1B組ZEB1 蛋白表達明顯減少（P＜0.05）。見圖1。

圖1 ZEB1 在SW620 細胞中有效下調

在ZEB1 沉默的SW620 細胞中，ECAR 降低，隨著時間變化，ECAR 呈現先降低、后升高、再降低的趨勢；在ZEB1 敲低的SW620 細胞中，OCR 增加，隨著時間變化，OCR 呈現先降低、后升高、再降低的趨勢。見表2。

表2 ZEB1 對結腸癌細胞的ECAR、OCR 影響()

2.2 ZEB1 維持ROS 生成和線粒體膜電位

當ZEB1 表達沉默時，ROS 產生減少（P＜0.05），線粒體膜電位增加（P＜0.05）。見表3。

表3 ZEB1 調節ROS 產生和線粒體膜電位()

注：與對照組比較，aP＜0.05

2.3 ZEB1 與結腸癌SIRT3 表達負相關

在ZEB1 沉默的SW620 細胞中，SIRT3 的mRNA水平顯著增加（P＜0.05），SIRT4 和SIRT5 的mRNA水平無明顯變化（P＞0.05）。見表4。在ZEB1 沉默的SW620 細胞中，SIRT3 的蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 ZEB1 敲低增加了SW620 細胞中SIRT3 的蛋白表達水平

表4 ZEB1 敲低增加了SW620 細胞中SIRT3 的mRNA表達水平()

表4 ZEB1 敲低增加了SW620 細胞中SIRT3 的mRNA表達水平()

注：與對照組比較，aP＜0.05

為了進一步探討ZEB1 和SIRT3 之間的相關性，分析了結腸癌患者中ZEB1 和SIRT3 的表達。IHC染色檢查ZEB1 和SIRT3 之間的表達相關，結果顯示：較高ZEB1 表達的結腸癌患者顯示較低SIRT3表達（圖3）。

圖3 較高ZEB1 表達的結腸癌患者顯示較低SIRT3 表達

2.4 SIRT3 是ZEB1 的轉錄靶標

雙重熒光素酶測定ZEB1 對SIRT3 啟動子熒光素酶活性的影響，結果表明ZEB1 以劑量依賴性方式抑制SIRT3 啟動子活性，結果如表5 所示。

表5 ZEB1 以劑量依賴性方式抑制SIRT3 啟動子熒光素酶活性

2.5 表觀遺傳因子MBD1 可與結腸癌細胞中ZEB1相互作用

ChIP 分析表明，ZEB1 與MBD1 相互作用（圖4A），且在SW620 細胞的細胞核中共定位（圖4B）。

圖4 表觀遺傳因子MBD1 可與結腸癌細胞中ZEB1 相互作用

2.6 MBD1 積極調節結腸癌細胞中有氧糖酵解和ROS 的產生

通過蛋白質印跡法驗證MBD1 沉默的SW620 細胞系的擊倒效率（圖5A）。接下來，使用海馬能量通量分析儀測試了MBD1 對糖酵解的影響。MBD1沉默抑制了SW620 細胞中的ECAR 值，MBD1 沉默細胞系中OCR 值增加，MBD1 沉默可降低結腸癌細胞中ROS 的產生（圖5B）。

圖5 MBD1 積極調節結腸癌細胞中有氧糖酵解和ROS 的產生

2.7 ZEB1 與MBD1 相互作用以抑制SIRT3 在結腸癌細胞中的表達

如上所述，ZEB1 負調節結腸癌細胞中SIRT3 的表達。接下來探究MBD1 是否在ZEB1 介導的SIRT3抑制中起輔助因子的作用。雙重熒光素酶檢測結果表明MBD1 抑制了SIRT3 啟動子活性，而ZEB1 與MBD1 的共轉染則更加顯著地抑制了SIRT3 啟動子活性。見表6。

表6 ZEB1 和MBD1 相互作用抑制SIRT3 啟動子熒光素酶活性()

表6 ZEB1 和MBD1 相互作用抑制SIRT3 啟動子熒光素酶活性()

注：*P＜0.05，**P＜0.01，差異有統計學意義

ChIP 分析證明ZEB1 和MBD1 在SIRT3 啟動子區域富集（圖6A）。reChIP 分析證明ZEB1 和MBD1同時占據SIRT3 啟動子的同一區域（圖6B）。總而言之，ZEB1 和MBD1 相互作用抑制SIRT3 表達，從而誘導結腸癌中有氧糖酵解。

圖6 ZEB1與MBD1相互作用以抑制結腸癌細胞中sirtuin 3 的表達

3 討論

越來越多的證據表明，EMT 在腫瘤進展中起重要作用[16]。EMT 在結腸癌發展中也起著關鍵作用。本研究結果表明，ZEB1 是糖酵解的負調節劑，在從線粒體到糖酵解的新陳代謝重編程過程中，線粒體呼吸受到損害，可以通過OCR 進行測試其在誘導和維持EMT 中起著重要作用，本研究結果表明，在ZEB1 沉默的SW620 細胞中，ECAR 降低，在ZEB1敲低的SW620 細胞中，OCR 增加，說明ZEB1 是線粒體呼吸的負調節劑，也說明ZEB1 是結腸癌中有氧糖酵解的正調節劑。ROS 的產生是糖酵解的凈結果，而糖酵解又對有氧糖酵解產生積極影響，ZEB1 表達沉默時，ROS 產生減少，說明ZEB1 在結腸癌細胞中對ROS 產生正向調節作用。癌細胞通過有氧糖酵解利用葡萄糖，在此過程中，線粒體膜電位降低。ZEB1 沉默后，線粒體膜電位增加，表明ZEB1 可以維持ROS 的產生并調節結腸癌細胞中的線粒體膜電位。Sirtuin 家族成員（包括SIRT1-7）是脫乙酰基酶，可調節細胞中的新陳代謝、衰老、能量和氧化還原穩態。其中SIRT3、SIRT4 和SIRT5 定位于線粒體并負向調節糖酵解。因此，本研究檢測了ZEB1 對SW620 細胞中SIRT3、SIRT4 和SIRT5 表達的影響。ZEB1 在其下游轉錄靶標的啟動子區域特異性結合E-box（CANNTG）或Z-box（CAGGTA）序列。本研究分析了SIRT3 的啟動子區域（從-2500 到+200），并確定了啟動子區域中潛在的Z 框。雙重熒光素酶測定ZEB1 對SIRT3 啟動子熒光素酶活性的影響，結果表明ZEB1 以劑量依賴性方式抑制SIRT3 啟動子活性。先前研究表明，表觀遺傳因子甲基-CpG 結合域蛋白1（MBD1）與TWIST 在結腸癌細胞中相互作用以誘導EMT。ZEB1 和TWIST 在促進轉移方面有共同的下游目標。因此，本研究驗證ZEB1 是否可以與結腸癌患者的MBD1 相互作用。MBD1 沉默抑制了SW620 細胞中的ECAR 值，表明MBD1 充當糖酵解的正調節劑。MBD1 沉默細胞系中OCR 值增加，表明MBD1 充當線粒體呼吸調節因子的負調節劑。MBD1 沉默可降低結腸癌細胞中ROS 的產生。這些結果證實MBD1 積極調節結腸癌細胞中的耗氧糖酵解和ROS 的產生。

在分化程度低的結腸癌樣品和分化的結腸癌腫瘤衍生的浸潤細胞中ZEB1 表達增加，因此其可作為結腸癌細胞存活的預后標志物。然而，很少討論ZEB1 對癌細胞代謝的影響。在乳腺癌中，EMT 調節劑SNAIL 通過抑制果糖雙磷酸酶1（FBP1）在誘導有氧糖酵解中起積極作用。FBP1 是糖酵解的負調節劑，可催化糖異生。在乳腺癌、透明腎細胞癌和胃癌中，FBP1 發揮抑癌作用。因此，SNAIL 介導的FBP1 抑制為侵襲性癌細胞帶來了代謝優勢[17]。研究表明，ZEB1 可抑制SIRT3 表達。SIRT3 是線粒體抑癌基因，對糖酵解有負調控作用[18]。除了其在調節葡萄糖代謝中的作用外，SIRT3 可調節癌細胞中的EMT 及EMT 轉移。例如，作為脫乙酰基酶，SIRT3可以使S 相激酶相關蛋白2（SKP2）脫乙酰基。脫乙酰基 SKP2 的連接酶活性降低，從而逆轉了EMT[19]。因此，SIRT3 充當EMT 的負調節器。

SIRT3 是一種腫瘤抑制因子，對糖酵解和EMT負調控。但是，很少討論SIRT3 失調在癌癥中的調控機制。過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ2α，一種調節線粒體發生的轉錄因子，也通過雌激素相關受體-α（ERR-α）調節SIRT3 表達，并且在啟動子中存在一個推定的ERR-α 投標元件SIRT3 的區域。另一個觀察結果是，SIRT3 隨ROS 產量增加而特異性上調。這種上調可以通過涉及轉錄因子（如Nrf2）的氧氣傳感機制來控制。在此過程中，還觀察到了ROS 水平的變化，因此可以認為EMT 調節劑可以對SIRT3 表達產生某些影響。據報道，MBD1 是一種可以與甲基化的CpG 島特異性結合的表觀遺傳因子，在結腸癌中被上調，并調節EMT 以及化學療法和放射療法的抵抗力[20]。在本研究中，ZEB1 與MBD1相互作用，并且這兩個蛋白共同占據SIRT3 啟動子區域，表明ZEB1/MBD1 復合物調節SIRT3 表達。

綜上所述，SW620 癌細胞中的ZEB1 通過與MBD1 相互作用沉默SIRT3 表達，從而導致線粒體能量代謝功能障礙，最終影響細胞轉移復發，可能是細胞對治療更加敏感的治療策略。本研究闡明了通過減少燃料供應和抑制糖酵解來抑制結腸癌轉移的可能性，發現了EMT 和糖酵解之間的新型聯系，為結腸癌提供了潛在的治療靶標。