一種改性復合膠原止血材料的制備及試驗

王水文，鄧厚斌，劉曉雯

(上海長征醫院，上海 200003)

在進行手術時，有一個重要環節就是止血，止血對于患者的安危和手術的成功都起到了很大的作用[1]。在進行腦、脾、腎、肝等臟器手術，腫瘤等血管薄弱的病變組織手術，凝血機能異常患者的手術時，僅僅采用縫合、結扎、電烙等機械止血方法是不夠的，還需要配合使用一些止血材料才能達到良好的止血效果[2]。

隨著醫學技術水平的不斷進步，止血方法和止血材料都有了很大的發展，醫用領域常用的止血材料有纖維蛋白膠，明膠海綿，凝血酶，氧化纖維素等[3-4]，這些材料與結扎、紗布等傳統的止血方法和材料相比，止血效果明顯更好，但是這些止血材料還是存在一些副作用和缺點，且止血速度不夠快。纖維蛋白膠屬于血液制品，有傳播血源性傳染病的風險，并且為了防止產生過敏反應或形成血栓不能直接注入血管內，另外纖維蛋白膠對于較大靜脈出血、動脈出血的止血作用并不理想。使用明膠止血時，明膠很可能造成傷口感染，并且由于粘附力較差比較容易脫落，用在內臟止血時需要進行縫合固定，另外明膠海綿的止血作用需要依靠體內的凝血因子，所以如果患者存在凝血機制障礙時，用這種止血材料止血并不能起到良好的止血效果[5-6]。凝血酶盡管能夠有效促進血小板的聚集，但是其價格較為昂貴。氧化纖維素具有酸性，容易引起神經纖維的變性，并且其具有很強大額吸水性，如果受潮了會對其止血作用造成影響。膠原止血材料則不存在這些缺點，其止血效果好，止血時間短，且沒有明顯的副作用，是一種非常理想的止血材料[7]。膠原能夠減少血栓的形成時間，加速血小板的聚集，同時血小板在膠原的刺激下，會釋放各種凝血因子等分泌物以及亞細胞顆粒，血小板所釋放的凝血因子會附著在受損的血管上，對受傷血管進行堵塞，從而起到止血的作用[8-9]。但是只單獨使用膠原對傷口進行止血，會因為較差的吸水能力影響血液濃縮效果，進而降低止血效率。所以現在使用的膠原止血材料都是和其他材料一起復合制備成的，由于鈣離子具有較為簡單的空間結構，能夠很容易地控制和清除，并且鈣離子濃度的升高有利于血小板的活化，而血小板的活化、粘附、聚集和血栓形成的過程均需要鈣離子的參與。透明質酸是一種哺乳動物細胞外基質糖胺聚糖，透明質酸的水溶液具有較強的粘性，可以對體內分子和細胞的滲透起到控制作用，同時影響細胞的分化，同時其免疫原性低，顯著降低異體反應和引發炎癥的可能性，同時透明質酸還具有優良的生物相容性和生物降解性[10]。這里我們用氯化鈣、透明質酸和膠原制備復合膠原止血材料，同時對其使用效果進行了研究分析。

1 復合膠原止血材料的提取、制備

1.1 膠原的提取

將5 g風干的牛跟腱剪碎，并溶于濃度0.5 mol/L的乙酸溶液，取胃蛋白酶2.5 g加入其中；之后將溶液攪拌均勻，使用離心機以4 000 r/min的轉速進行離心，時間30 min。將上層清液取出，向其中加入50 mL質量分數20%的氯化鈉溶液，同樣以4 000 r/min的轉速離心15 min。然后，取其沉淀物大概100 mL，加入400 mL蒸餾水，15 mL乙酸，放入透析袋里面，透析4 d，并且每天都要換水，進行透析；完成后進行冷凍干燥處理，保存備用。

1.2 膠原的制備

在0.5 mol/L乙酸溶液中溶入提取好的膠原冷凍產物，取透明質酸0.2 g后攪拌均勻， 然后將溶液中的氣泡排出后倒入模具，控制溶液厚度1～5 mm，進行冷凍干燥處理，即可獲得防粘連層。另外,再取相同質量的膠原冷凍產物，將其在質量分數0.3%的乙酸溶液中溶解，再向其中加入0.5 g甘油，氯化鈣0.1 g，攪拌均勻后倒在防粘連層表面，即可獲得厚度為2～10 mm的復合膠原止血材料(見圖1)。取50 mmol/L碳化二亞胺的體積分數為95%的乙醇溶液，將凍干海綿浸入其中，常溫浸泡4 h，讓其反應完全后使用離子水沖洗后凍干，再用60Co對其進行輻照消毒，最后保存備用。

圖1 復合膠原海綿止血材料Fig.1 Composite collagen sponge hemostatic material

2 試驗材料與方法

2.1 試驗材料

DMEM/F-12培養基、胎牛血清、蘇木精、甲醛；伊紅等組織切片、染色用試劑、L-929小鼠成纖維細胞，普通級健康成年雄性新西蘭大白兔18只，質量約2 kg/只。

紫外分光光度計、冷凍干燥機、精密酸度計、電子天平、電熱恒溫鼓風干燥、多用振蕩器、水平搖床、磁力攪拌器和掃描電子顯微鏡。

2.2 試驗方法

2.2.1對復合膠原止血材料的細胞毒性進行檢測

取3 cm×3 cm的復合膠原止血海綿浸入10 mL的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)低糖完全培養液；之后，在溫度37 ℃的孵箱內孵育48 h。然后，取其上層清液，并進行2倍稀釋。

按照相關規定進行細胞毒性檢測。取L-929細胞，然后將其胰蛋白酶傳代培養至第3代，細胞濃度4×107cfu/L鋪板，每孔100 μL，將其分為3組進行培養。陰性對照組加入200 μL的細胞培養液，陽性對照組加入200 μL的質量濃度64 g/L的苯酚溶液，試驗組加入200 μL復合膠原海綿止血材料浸提液。將3組進行細胞貼壁培養1、3和6 d后，向其加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min。用酶標儀檢測在波長490 nm下的吸光值，并求平均值。在每孔中加入20 μL質量濃度5 g/L的噻唑藍(MTT)，在溫度37 ℃條件下孵育4 h，然后去除上層液體并控干，再向每孔中加入DMSO150 μL，均勻混合10 min。最后，對其進行吸光值測定，將測定的吸光值記作A值。

計算細胞的相對增值率，計算公式：

a=實驗組A-陽性對照組A

b=陰性對照組A-陽性對照組A

細胞相對增值率=a/b×100%

經過計算后，如果相對增值率大于等于100%，表明材料的等級為0級，即材料沒有細胞毒性，材料合格；如果計算結果處于75%～99%，表明材料等級為1級，即材料的細胞毒性極低，材料合格。

檢測結果發現細胞培養2、4和7 d后，試驗組的A值與陰性對照組比較差異顯著(P>0.05)；與陽性對照組比較，其A值均高于陽性對照組(P<0.05)，具體結果如表1所示。

表1 MTT法檢測復合膠原止血材料的細胞毒性Tab.1 MTT assay was used to detect the cytotoxicity of composite collagen hemostatic materials

由表1可知，在培養第2、4、7 d后的相對增值率分別為(98.0±8.2)%、(99.0±2.5)%和(96.0±3.4)%，表明該復合膠原止血材料的細胞毒性為1級，屬于合格材料。

2.2.2對復合膠原止血材料進行體外凝血活性檢測

選擇BIC凝血指數做體外測試，取3只相同的燒杯，分別加入相同量的進口和國產止血材料，抽取200 μL家兔抗凝全血，向燒杯中緩慢滴入，再向其中加入濃度0.2 mol/L的氯化鈣溶液20 μL；啟動血液凝固，靜止5 min，取去離子水25 mL加入3個燒杯中，保持37 ℃恒溫條件下靜止5 min，然后將溶液取出，再用波長540 nm的紫外分光光度計測量其吸光值。另外，取血液0.1 mL，用水稀釋至25 mL，在540 nm波長下測定吸光度值，A值設定為參考值100。根據計算公式即可獲得凝血數值BIC，BIC=100×樣品A/參考A，凝血效果越好則凝血指數BIC的數值越低，將每個樣品都進行5次檢測實驗。

結果發現，復合膠原海綿止血材料的體外凝血指數為18.28±52.145，進口止血材料和國產止血材料的凝血指數分別為23.145±1.142、3.126±2.275，表明復合膠原止血材料的凝血指數顯著低于國產和進口止血材料，說明復合膠原止血材料的體外凝血效果更好。

2.2.3對復合膠原止血材料進行體內止血效果檢測

選擇18只新西蘭大白兔，并隨機分為3組，對這3組新西蘭大白兔分別使用進口、國內止血材料和復合膠原止血材料。將新西蘭兔麻醉后仰臥固定在手術臺上，然后一層一層地將其腹部縱向切開，用無菌紗布將組織液和血液吸干。暴露出其肝臟部位，在其右中葉進行肝葉鉆透，等待25 s，讓其自由出血；然后將止血材料覆蓋在鉆孔上，并快速將已知質量的無菌紗布鋪在止血材料上，再將鐵片壓在無菌紗布上，同時開始計時，每隔40 s觀察1次；如果沒有血液滲出了，表示血已止住，將時間記錄下來，記作出血時間。最后，對紗布的質量進行稱量，將紗布的質量差記作出血量。

以新西蘭兔標準肝創模型中的止血時間和出血量作為考察指標，具體結果如表2所示。

表2 復合膠原的止血效果比較Tab.2 Comparison of hemostatic effects of composite collagen

由表2可知，相比國產止血材料和進口止血材料組，試驗組的止血時間和出血量都明顯更低(P<0.05)，且BIC測試結果與此次試驗結果一致；試驗組的各項指標與國產和進口止血材料組相比，其止血時間分別縮短了65.8%和27%，出血量分別減少了100%和25%，且差異均顯著(P<0.05)。結果表明，復合膠原止血材料不僅能夠顯著減少失血量，還可大大縮短傷口的止血時間，具有很高的臨床止血應用價值。

3 討論

3.1 止血材料

根據相關數據顯示，絕大部分創傷患者都由于失血過多死亡，所以現在急需一種快速有效的止血材料，醫學家和材料學家們都在致力于研發出防粘連的新型止血材料[13]。如果止血材料在止血和防粘的同時，可以有效促進損傷組織的修復，那么將更加適合于臨床應用[14]。傳統的止血方法都有或多或少的缺陷，因此還需要進一步研究開發出新型高效的止血材料和方法，優良的止血材料需要止血迅速，并且無毒、無抗原性，對組織愈合不造成任何影響，同時不會增加感染風險，并且經濟實惠[15]?，F有的國內外止血材料都還沒有達到這個水平，還需要科研人員的進一步開發研究。

3.2 膠原海綿止血材料

隨著科學技術水平的不斷提高，關于止血材料的研究也在飛速發展，也陸續研發出了多種不同的止血材料，目前常用的止血材料有氧化再生纖維素、膠原海綿、殼聚糖、可吸收明膠海綿等等。近些年來關于膠原蛋白止血材料的研究一直都是國內外的研究熱點，并且取得了一定的研究成果，開發了諸如片狀、粉狀、棉絮狀、海綿狀及纖絲狀等多種劑型[16-17]。海綿狀的材料對于淺而寬的創面止血效果較好，而棉絮狀和粉末狀的材料對于深而窄的創面的止血效要更好一些。目前使用的膠原止血海綿多是通過冷凍干燥技術來制備的，其整體呈三維形態，表面結構完整，具有較好的止血效果，另外通過調節預凍溫度，能夠改變材料的孔徑結構如圖2所示。實現對材料微結構的控制[18]。當然，也有一定缺陷，膠原經過人工處理后，在后期的自然狀態下很難保存，同時也會降低膠原的各項性能，因此近些年來由許多研究人員都嘗試通過改性研究提升膠原的性能，希望將其各項性能進一步優化。

圖2 一種具有孔隙大小自適應調節的膠原海綿Fig.2 Collagen sponge with adaptive adjustment of pore size

3.3 復合膠原止血材料的制備

目前膠原的提取方法有2種：一種是生物化學工程合成法；還有一種是生物材料提取法，生物材料提取法的技術路線已經相對成熟，比較常用的有堿法、酸法、酶法以及酶酸混合法等方法。酸法、堿法和酶法還存在一些缺陷，容易使膠原三螺旋結構破壞，使膠原產生少量的變性；酶酸混合法則可以改善單一方法中存在的問題，而且酶酸混合法提取出來的膠原純度更佳。膠原都是從生物材料中提取的，會造成內部共價鍵的破壞，影響膠原材料的力學強度，會使得其更快的分解，因為需要用到交聯劑[19]。物理交聯盡管可以避免殘留外源有毒試劑，但是物理交聯法這種方法的交聯不夠徹底，交聯度低，化學交聯需要引入外源有毒試劑，交聯后會有有毒試劑的殘留，清除起來十分困難。

現有的且使用較多的都是一些高分子聚合物等物質與膠原復合而成的止血材料。但還是存在一些問題，比如韌性不太理想，膠原在吸收了血液后有可能和與其混合的其他材料形成相互影響，進而導致材料的止血效果減弱[7]。所以需要利用物理或者化學方法，使膠原材料與多種其他成分進行復合，制成新型的止血材料。透明質酸是類糖胺聚糖物質，在組織工程中的應用十分廣泛。有學者交聯了水溶碳化二酰亞胺與多孔的透明質酸/膠原復合膜，透明質酸和膠原之間由于碳化二酰亞胺的作用下可以形成酯鍵和酰胺鍵，進而達到交聯的目的[20]。

3.4 復合膠原止血材料的應用

透明質酸可以控制膠原成纖維的形成，制備而成的膠原復合止血材料細胞毒性為1級，屬于合格產品。觀察發現復合膠原止血材料成疏松的多孔海綿狀，其微結構均勻。通過對比與國產和進口止血材料，發現全血與復合膠原止血材料能夠進行互相促進，促進形成交替而海綿狀，與血液形成了良好的關系。在體內觀察試驗中，使用復合膠原止血材料后，肝缺損的止血時間和出血量都有了很大的改善，同時止血材料與傷口的粘附更加緊密，有效地避免了其他組織與傷口的粘連。綜上所述，復合膠原止血材料具有良好的止血效果，解決了一些傳統止血材料所存在的問題，其在醫用領域中具有很高的應用價值。

3 結語

隨著現代科學和醫學技術的不斷進步和發展，對止血材料的要求在不斷提高，這就需要科研人員開發出止血效果更好的新型多功能止血材料，理想的止血材料首先需要具有優良的止血效果，同時沒有明顯的副作用，成本低廉容易獲得。而復合膠原止血材料剛好符合這些要求，另外，膠原在體內可以自行降解，不需要另外拆除，使用起來十分方便。隨著對復合膠原止血材料的進一步研究開發，相信其在醫學領域的應用范圍會越來越廣泛。