多花黃精產吲哚乙酸內生菌的分離篩選及其對黃精種子萌發的影響

杜佳慧 徐偉芳 楊曉冬 譚松 尹登科，2，3 劉園旭，2

（1.安徽中醫藥大學藥學院，合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院藥物制劑研究所，合肥 230012；3.中藥研究與開發安徽省重點實驗室，合肥 230012）

多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua.）為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）多年生草本藥用植物，是2015年版《中國藥典》收載的中藥黃精基原植物之一［1］。多花黃精以其干燥根莖入藥，有補氣養陰、健脾益腎等功效，多用于治療脾胃氣虛、肺虛燥咳、體倦乏力等癥，是傳統經典的藥食同源植物之一［2-3］。目前，多花黃精的繁殖方式主要依靠無性繁殖和有性繁殖［4］。其中，根莖無性繁殖是黃精傳統繁殖方式，但這種方式繁殖系數低，不僅消耗大量藥材，而且存在著病蟲害嚴重及種性退化等問題［5］；而有性種苗繁育技術可提高繁育系數，但種子具有形態及生理休眠等特性，萌發時間長且萌發率較低，在一定程度上導致種子繁殖困難等一系列問題［6-7］。此外，隨著多花黃精市場需求量的增加，加上人類長期以來的過度采挖，以及多花黃精生長受限，資源恢復困難等因素導致多花黃精資源十分匱乏［8］。因此，尋找一種綠色環保、安全有效的方法來解決多花黃精資源短缺的現狀具有重要意義。

植物內生菌（endophyte）是指生活史中一定階段或全部階段在健康植物組織和器官內部與植物共生，但不引起宿主植物發生明顯病害特征的一類微生物群體，包括內生細菌和內生真菌［9］。作為植物微生態系統的重要組成部分，內生菌構筑了宿主植物的健康屏障，且可通過垂直傳播使子代植物具有相似的內生菌群［10］。內生菌可通過產生植物激素，如吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）來直接促進宿主植物生長［11］。IAA 是一種調節植物生長的重要信號物質，其在植物生長過程中起到促進細胞生長、增加細胞體積和質量、促進細胞分裂分化、調節植物生根等方面的作用［12-14］。有關玉米［15］、花生［16］、馬鈴薯［17］、辣椒［18］等多種植物內生菌的研究結果表明，產IAA 內生菌因能促進宿主植物生長與增強植物抗逆性而被廣泛應用，具有研制成微生物肥料的巨大潛力。然而，利用產IAA 內生菌來促進黃精植物種子萌發和改善其生長發育的相關研究鮮見報道。

因此，本研究以多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua.）為植物材料，利用傳統的組織分離培養法從多花黃精根部分離純化內生細菌和內生真菌，從中篩選出可分泌IAA 的內生菌分離株，并利用形態學觀察、生理生化檢測、分子生物學方法詳細鑒定目標功能菌株，進一步利用溫室種子發芽實驗檢測其促生功效，以期為利用內生菌解決多花黃精繁殖難題并提高宿主多花黃精產量奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料 新鮮多花黃精樣品采自安徽中醫藥大學“沁馨園”藥園（31°56′19″N，117°23′20″E），該植物經安徽中醫藥大學楊青山老師鑒定為百合科黃精屬的多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua.）。黃精種子購自中藥植物市場。

1.1.2 供試培養基 高氏I 號培養基（GA）：可溶性淀粉20.00 g，KNO31.00 g，NaCl 0.50 g，K2HPO40.50 g，MgSO40.50 g，FeSO40.01 g，瓊脂15.00-20.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4；營養瓊脂培養基（NA）：蛋白胨10.00 g，牛肉膏3.00 g，NaCl 5.00 g，瓊脂15.00-20.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4；Luria-Bertani 固體培養基（LB）：胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，NaCl 10.00 g，瓊脂15.00-20.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂15.00-20.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然；察氏培養基（CZA）：NaNO33.00 g，K2HPO41.00 g，KCl 0.50 g，MgSO40.50 g，FeSO40.01 g，蔗糖30.00 g，瓊脂15.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然。以上培養基不加瓊脂即為對應的液體培養基，且均在121℃高壓滅菌20 min 備用。

1.1.3 主要試劑 基因組DNA 提取試劑盒PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent（ 美國ABI 公司，批號4318930）；革蘭氏染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G1060）；細菌生理生化檢測鑒定試劑盒（廣東環凱微生物科技有限公司，批號5110110）；99.8%吲哚乙酸（上海源葉生物科技有限公司，批號B21810）；Taq PCR Mix 預混液、DNA 分子量標準Marker、DNA 引物等常規分子試劑（上海生工生物工程股份有限公司，批號分別為B639295-0005，B500350-0500）；可溶性淀粉、蔗糖（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為S11006、S11055），蛋白胨、牛肉膏（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為T8490、G8270），葡萄糖、NaCl 等（國產分析純，批號分別為10010518、10016318）。

1.1.4 主要儀器設備 SW-CJ-1D 超凈工作臺（蘇州博萊爾凈化設備有限公司），41317065 電熱恒溫培養箱（美國Thermo），THZ-82A 數顯氣浴恒溫振蕩器（常州普天儀器制造有限公司），YM100 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司），427029 倒置顯微鏡（德國萊卡），3711293 PCR 儀（德國耶拿），DYY-8C 型水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），D07745 凝膠成像儀（德國耶拿），UV-1000 型紫外可見分光光度計（上海翱藝儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多花黃精內生菌的分離與保種 參考謝潔等［19］的方法進行多花黃精根部的表面消毒和內生菌的分離，并利用平板劃線法和菌絲頂端純化法純化內生細菌和內生真菌。純化后的內生菌進行甘油保種，并置于-80℃冰箱備用。

1.2.2 產IAA 菌株的篩選 采用Salkowski 比色法［20］對IAA 產生菌進行篩選。將獲得的內生細菌和內生真菌活化后，分別接種于LB 液體培養基和PDB 培養基中進行搖床培養，其中內生細菌培養溫度為28℃，發酵時間為3 d，內生真菌培養溫度為25℃，發酵時間為7 d。發酵結束后，在12 000 r/min 條件下離心30 min，取發酵上清液進行IAA 檢測，具體檢測方法參照文獻［20］。在本實驗中，以培養基作為陰性對照，以30 mg/L IAA 標準溶液作為陽性對照，若待測菌株發酵液與Salkowski 顯色試劑的混合液出現紅色反應，則說明有IAA 的產生，且紅色越深說明IAA 產量越高。

1.2.3 產IAA 菌株的定量檢測 標準曲線的制備：取蒸餾水和IAA 標準品制備標準溶液，濃度分別為5、10、15、20、30、40、50、100 mg/L，將配置好的標準液與Salkowski 顯色劑按體積比1∶1 混合后室溫避光放置30 min。以蒸餾水與Salkowski 顯色劑等體積混合作為空白對照，用紫外分光光度計測定OD530處各濃度的吸光度，以IAA 標準品各濃度為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標，繪制IAA 標準曲線。

IAA 含量測定：將新鮮的產IAA 菌株接種到LB液體培養基中，于28℃的搖床振蕩培養。發酵24、36、72、96 和120 h 后，按上述方法分別測定1 mL菌株發酵上清液與Salkowski 顯色劑反應后的OD530的吸光值，再根據IAA 標準曲線計算相應的IAA含量。

1.2.4 產IAA 菌株的菌種鑒定

1.2.4.1 產IAA 菌株的形態學鑒定 將上述產IAA活性明顯且穩定的促生菌接種于新鮮的LB 培養基上，28℃培養箱中培養18-24 h，觀察單菌落的大小、形狀、顏色、透明度等特征。同時，將培養24 h 和48 h 的細菌分別進行革蘭氏染色和芽孢染色，具體操作方法見參考文獻［21］。

1.2.4.2 產IAA 菌株的生理生化鑒定 參照文獻［22］的方法進行糖或醇（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇）的發酵試驗、甲基紅試驗及乙酰甲基甲醇試驗（MR-VP）等生理生化特性的測定。

1.2.4.3 產IAA 菌株的分子生物學鑒定 利用基因組試劑盒Prepman Ultra Sample Preparation Reagent（Applied Biosystems，USA）說明書中的方法提取各菌株的總DNA，并以其為模板，參照文獻［23］中的細菌通用引物27F 與1492R 進行PCR 擴增反應。PCR 擴增反應體系（總體積25.00 μL）與PCR 反應條件分別參照文獻［24-25］。擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的基因序列與National Center for Biotechnology Information（NCBI）的網站數據庫進行（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對，并下載同源性較高序列，使用MEGA 7.0 軟件，以鄰接法（neighbor-joining method）構建系統進化樹。以上測序結果均提交至GenBank 數據庫，以獲得序列登錄號。

1.2.5 目標菌株對黃精種子萌發的影響 種子萌芽實驗參照周新華［26］的方法并稍作修改，本研究共設4 個實驗組：（1）HNC2 菌株菌懸液；（2）HNC2 菌株發酵上清液；（3）HPB1 菌株菌懸液；（4）HPB1菌株發酵上清液。其中，菌懸液是由目標菌株經LB培養基發酵24 h 離心后，菌體沉淀用無菌水重懸并調節濃度為1.0×108CFU/mL，發酵上清液是由目標菌株經LB 培養基發酵24 h 離心后直接取上清獲得。另設3 個對照組：（1）無菌水；（2）LB 培養基；（3）IAA 標準品（100 mg/L）。按上述分組進行24 h 浸種處理，浸種結束后，取各組種子置于鋪有濕潤無菌濾紙的玻璃平皿（直徑=9 cm）中，每皿20 粒種子，每個處理3 個重復，于25℃、12 h/12 h 光照黑暗交替、濕度為90%的人工氣候培養箱中靜置培養。每天加無菌水維持濕度，連續保濕培養22 d，并于第12 天調查種子發芽勢，第22 天統計其發芽率。培養結束時，統計萌發幼苗的胚芽長、胚根長以及子葉寬度等指標，觀察目標菌株菌懸液與發酵上清液對黃精種子發芽的影響［27］。

種子發芽勢及發芽率計算方式：發芽勢（%）=處理后第12 天發芽種子數/供試種子數×100%；發芽率（%）=處理后第22 天發芽種子數/供試種子數×100%。

1.2.6 數據分析與處理 IAA 標準曲線和含量測定采用Origin 2018 軟件作圖。實驗數據采用SPSS 23.0統計分析軟件處理，多組間差異比較采用單因素方差分析檢驗，均數多重比較采用LSD 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃精內生菌的分離

利用LB、PDA、NA、GA 和CZA 培養基，現從多花黃精根部中分離培養并純化出內生菌34 株，包括內生細菌25 株，內生真菌9 株（表1）。純化后的菌落形態如圖1和2 所示。

表1 多花黃精內生菌分離情況統計Table 1 Statistics of endophytes isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.

圖1 部分多花黃精內生細菌在LB 培養基上的形態Fig.1 Morphology of some endophytic bacteria isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.on LB medium

圖2 多花黃精內生真菌在PDA 培養基上的形態圖Fig.2 Morphology of endophytic fungi isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.on PDA medium

2.2 產IAA菌株的篩選

以分離獲得的多花黃精內生菌為基礎，從中初步篩選出7 株具有產IAA 功能的內生細菌，具體初篩情況如表2所示。在本研究中，并未篩選到產IAA 能力的內生真菌。經多次IAA 活性檢測后發現，編號為HNC2、HPB1、HPB3 的內生細菌發酵液能穩定與Salkowski 試劑反應呈紅色（圖3）。

圖3 多花黃精內生細菌產IAA 能力的定性檢測Fig.3 Qualitative detection of IAA-production ability of endophytic bacteria isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.

表2 產IAA 能力的多花黃精內生菌初篩統計Table 2 Statistics of IAA-producing ability of endophytic bacteria isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.

配制不同濃度IAA 溶液制成標準曲線，如圖4-A所示，標準方程為：y=0.015 3x+0.055 2，R2=0.992 9。促生菌株的IAA 定量實驗結果顯示，隨著培養時間的增加，菌株分泌IAA 的能力均呈現先上升的趨勢，達96 h 后，HNC2 菌株和HPB1 菌株分泌IAA的能力呈下降趨勢，HPB3 菌株微呈上升趨勢。其中HNC2 和HPB1 菌株分泌IAA 的含量在第96 小時達到最高值，分別可達4.833 mg/L、4.608 mg/L，均明顯高于HPB3 菌株在發酵第120 小時分泌IAA 的峰值（4.524 mg/L）（圖4-B）；同時HPB3 菌株在每個發酵時間點分泌IAA 的能力均明顯弱于HNC2 和HPB1 菌株。因此，將兩株分泌IAA 能力穩定且含量較高的內生細菌HNC2 和HPB1 作為后續實驗研究對象。

圖4 IAA 標準曲線（A）與多花黃精內生菌分泌IAA 的含量隨時間的變化趨勢（B）Fig.4 IAA standard curve（A）and trends of the content of IAA secreted by endophytic bacteria of Polygonatum cyrtonema Hua.over time（B）

2.3 產IAA菌株HNC2和HPB1的鑒定

2.3.1 形態學特征觀察 HNC2 菌株在LB 培養基28℃培養24 h，菌落呈白色、圓形，表面光滑不透明（圖5-A），該菌株顯微形態觀察為長桿狀，革蘭氏染色呈藍紫色，為革蘭氏陽性菌（圖5-B），芽孢染色結果表明該菌株能產芽孢（圖5-C）；HPB1 菌落形態則為表面光滑的圓形，乳白色，且為透明狀（圖5-D），顯微形態觀察為圓球形，革蘭氏染色實驗結果表明其為革蘭氏陽性菌（圖5-E），不能產生芽孢。

圖5 HNC2 和HPB1 菌株的菌落及菌體形態特征Fig.5 Colony and morphological characteristics of HNC2 strain and HPB1 strain

2.3.2 生理生化檢測 生理生化檢測顯示：HNC2菌株可利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖；MR 試驗陽性；尿素試驗為陰性。HPB1 菌株尿素試驗為陽性；不可利用糖類物質如葡萄糖、乳糖等；MR 試驗陰性。二者VP 試驗均為陽性；均可分解蛋白胨中的色氨酸，產生吲哚；均可利用西蒙氏檸檬酸鹽；均可在半固體瓊脂培養基中擴散生長，表明其具有運動性；均不可利用乳糖、甘露醇；均不可分解培養基中含硫化合物（表3）。

表3 HNC2 和HPB1 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of HNC2 strain and HPB1 strain

2.3.3 分子生物學鑒定 以多花黃精產IAA 菌株HNC2 和HPB1 的DNA 為模板，經PCR 反應擴增后，成功獲得長度分別為1 454 bp、1 457 bp 的16S rDNA 基因序列。進一步將序列提交至GenBank中，得到菌株登錄號分別為MZ298557、MZ315031。基于16S rDNA 的序列比對及系統發育分析結果表明，HNC2 與登錄號為MT516449 的菌株Bacillussp.的相似性高達99.93%，并與其處于同一最小分支（圖6-A），而HPB1 菌株與登錄號為KY264989的菌株Staphylococcussp.同源性很高，且與其處于同一最小分支（圖6-B）。

圖6 HNC2 菌株（A）與HPB1 菌株（B）基于16S rDNA序列的系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of HNC2 strain（A）and HPB1 strain（B）based on 16S rDNA sequence

結合形態學、生理生化特征，及基于16S rDNA序列的系統發育分析結果，故將HNC2 鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），命名為Bacilussp.HNC2，將HPB1 鑒定為葡萄球菌屬（Staphylococcussp.），命名為Staphylococcussp.HPB1。

2.4 產IAA菌株HNC2和HPB1對黃精種子萌芽的影響

將黃精種子進行紙床培養，不同處理組的種子萌芽時間、發芽勢、發芽率以及萌發幼苗生長狀況均有所差別。（1）從萌芽時間上看，HNC2 和HPB1發酵液處理組中的黃精種子分別在第4 天和第8 天開始發芽，而LB 培養基對照組則在第9 天開始發芽；HNC2 和HPB1 菌懸液處理組中的種子均在第6天開始發芽，而無菌水對照組則第11 天開始發芽，且IAA 陽性對照組在第7 天開始發芽；（2）從發芽勢和發芽率上看，無論是菌懸液處理組還是發酵液處理組，HNC2 菌株和HPB1 菌株均能明顯提高黃精種子的發芽勢和發芽率，尤其是在發芽勢指標上表現更為明顯：與LB 培養基對照相比，HNC2 發酵液處理組和HPB1 發酵液處理組的發芽勢分別提高了366.60%和133.40%；與無菌水對照相比，HNC2菌懸液處理組和HPB1 菌懸液處理組的發芽勢分別提高了173.58%和223.43%（表4）；（3）從幼苗生長指標上看，盡管胚根長、胚芽長及葉寬在各菌株間未出現顯著性差異，但仍可以看出，經HNC2 菌懸液處理的種子胚芽長（20.10 mm）優于無菌水對照組（19.47 mm）；兩株菌懸液處理組種子胚根長（HNC2 14.60 mm；HPB1 12.23 mm）及葉寬（HNC2 2.73 mm；HPB1 2.53 mm）優于無菌水對照組（胚根長6.83 mm；葉寬1.73 mm），這種促生效果亦體現在菌株發酵液處理組（表4）。

表4 內生細菌HNC2 和HPB1 對黃精種子發芽的影響Table 4 Effects of endophytic bacteria HNC2 and HPB1 on the germination of Polygonatum seeds

3 討論

國內外研究表明，植物內生菌不僅可以有效提高宿主植物的生長發育，且在增強植物對病蟲害抵抗能力方面亦發揮重要作用［28］。內生菌可從溶磷、解鉀、固氮作用、產生鐵載體和分泌植物生長激素［29］等方面直接促進宿主植物生長，也可通過產生抗菌化合物和分泌活性酶等提高宿主植物對各種病蟲害和病原菌的抵抗能力，從而間接促進植物生長［30］。Xu 等［31］從桑樹33 株拮抗菌中篩選出8 株能夠促進桑苗生長的內生菌，其中芽孢桿菌屬Bacillussp.CW16-5 的促生能力最強；Swain 等［32］研究發現，與未用細菌懸浮液處理的山藥相比，經產IAA 的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌懸液處理后，山藥根和莖的生物量均有所提高；康慧穎等［33］從苜蓿組織內分離得到能夠產生IAA 的短小芽孢桿菌B.pumilusALR33，且該菌株對紫花苜蓿的促生作用明顯；陽湖榮等［34］從白術中分離得到能夠合成IAA的B.endophyticusAMR83，且該菌株能夠促進白術組培苗根部生長［34］；傅曉方等［35］從健康玉米植株根莖中分離篩選得到4 株均具有不同程度的固氮酶活性和產IAA 能力的菌株，其中L2A2 菌株被鑒定為巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri），其對小麥幼苗具有明顯的促生作用。綜合前人研究發現，以產IAA促生菌為生物肥料已廣泛應用于中藥材等各類植物的生產研究上。

然而，截止目前，關于多花黃精內生菌促生效果的報道較少。本研究從34 株多花黃精內生菌中篩選出兩株高產IAA 的促生菌Bacillussp.HNC2 和Staphylococcussp.HPB1，其產IAA 能力分別可達4.833 mg/L、4.608 mg/L，明顯高于遲慧榮等［36］從多花黃精中分離得到的貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）產IAA 的含量0.008 29 mg/L。同時，黃精種子萌發實驗結果顯示，與無菌水和培養基對照相比，本研究篩選得到的兩株產IAA 菌株可顯著促進宿主種子萌發及其幼苗生長，這種經內生菌處理提高植株種子萌發的優勢可能與其產生IAA，打破種子休眠，從而提高萌芽率有關。此外，HNC2 菌株促進種子萌芽的能力優于IAA 標準品，猜測該促生菌除了分泌IAA 外，還可能同時產生其他植物激素，或通過溶磷、解鉀和生物固氮等作用促進植物生長發育。本研究獲得的兩株多花黃精促生菌（Bacillussp.HNC2和Staphylococcussp.HPB1）在一定程度上可為制備微生物肥料提供新的菌種資源，但兩株菌株在多花黃精體內的定植情況，及對野外條件下黃精植株生長的影響不明確，有待進一步研究與探索。

4 結論

本研究從多花黃精根部篩選出兩株具有穩定高產IAA 的內生細菌HNC2 和HPB1，經鑒定分別為芽孢桿菌（Bacillussp.）和葡萄球菌（Staphylococcussp.）；黃精種子萌發實驗結果表明，Bacillussp.HNC2 和Staphylococcussp.HPB1 均對黃精種子萌發具有促生功效，具備開發作為微生物肥料的條件。