石榴花發育相關基因PgSPL2的克隆及功能研究

甘誠燕 張心慧 王沙 樊瑤羽薇 招雪晴 苑兆和

（南京林業大學林學院 南方現代林業協同創新中心，南京 210037）

SQUAMOSA 啟動子結合類蛋白（SQUAMOSA promoter binding protein-like，SPL）是一類特異存在于植物中的轉錄因子，在植物生長發育中起重要作用［1］。該蛋白含有76 個氨基酸組成的SBP 結構域，包含2 個鋅指結構和1 個核定位信號［2］，能夠識別并結合SQUAMOSA 啟動子，參與花發育的調控，能參與調控植物的開花時間、成花轉變、花序及花柄的發育以及花器官發育等生物學過程［3］。

SPL 是多基因家族，在多種植物中被分離鑒定，AtSPL3、AtSPL2、AtSPL10、AtSPL11可激活花分生組織特異基因LFY、FRUITFULL（FUL）和APETALA1（AP1）的表達［4］，促進花誘導或花分生組織同一性［5］，調控開花時間和成花轉化。如異源轉化葡萄VvSBP11，促使擬南芥提早開花，表明VvSBP11可促進葡萄從營養生長向生殖生長轉變［6］；與擬南芥類似，當沉默金魚草AmSBP1會延遲開花時間［7］；在煙草中過量表達NtSPL3可以促進煙草早開花［8］。

石榴（Punica granatumL.） 是千屈菜科（Lythraceae）石榴屬（Punica）的落葉小喬木［9］，栽培范圍廣泛，是集生態、經濟價值于一體的優良樹種［10］。隨著國家鄉村振興策略發展，石榴產業欣欣向榮，成為脫貧攻堅、特色小鎮建設等的良好選擇，因此，近年來我國石榴發展面積不斷壯大。根據花器官構造的不同，Wetzstein 等［11］將石榴花分為兩性花（完全花）和功能性雄花（不完全花）兩種類型，完全花雌蕊正常發育，最后形成果實；不完全花不能受精結實，最后脫落［12］。石榴在生長發育過程中花期長、花量大，但因雌蕊敗育、落果現象嚴重，自然坐果率低。研究發現影響石榴產量的因素主要是冬春季的凍害和花期連陰雨［13］，仲春是石榴第三批花芽分化的高峰期［14］，寒冷天氣會使花芽內部組織發育不正常，影響花芽分化［15］，對于已經開放的花，輕者花瓣、花藥、花絲和雌蕊會變褐變黑，重者則子房變褐［16］，嚴重影響石榴花的生長發育。且石榴花期正值春夏之交，大多年份都會出現10 d 左右的連陰雨，花粉容易受到雨水沖刷，加上光照不足，營養物質積累不足，花芽分化質量差，授粉不良［17］，導致其經濟效益得不到提高，影響生產發展。因此，通過噴施生長調節劑延遲花期避開自然災害的措施，對石榴花發育的影響具有重要意義［18］。

前人研究已證實SPL 轉錄因子在調控開花時間和成花轉變中有重要作用，但在石榴花發育中是否有作用還未被闡明。

本研究以‘突尼斯’軟籽石榴為試材，采用同源克隆基因技術從石榴葉片、籽粒、花和果皮的混合樣品中分離出PgSPL2，并對其進行生物信息學分析，通過過表達擬南芥驗證PgSPL2對花發育的影響，對石榴花進行不同生長調節劑噴施處理后分析該基因的表達特性以探究，為進一步研究石榴花發育的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試驗材料為種植于江蘇省南京市六合區虎崗石榴園的‘突尼斯’軟籽石榴。選擇樹勢一致，生長狀態良好的石榴樹作為試驗標準株。選取多效唑（PP333）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）和吲哚丁酸（IBA）3 種植物生長調節劑以及清水作為對照組（CK）進行噴施至葉面滴水，每個處理噴施9 株，3 株用于采樣，3 株用于統計。處理時保證各處理植株間的相對距離，以盡量排除相互之間的影響。分別于2021年4月20日（春季展葉期）、5月15日（始花期至盛花期）、5月30日（盛花期末）進行單株處理，自5月10日起每7 d 采集不同發育階段的完全花與不完全花，參照陳利娜［19］對石榴花形態及胚胎學差異的研究，按照花蕾縱徑的大小分為3 個階段（圖1），P1：花蕾縱徑3.0-5.0 mm；P2：花蕾縱徑5.1-13.0 mm；P3：花蕾縱徑13.1-25.0 mm，以及完全花相對應的時期，以清水組（CK）為對照，液氮處理后-80℃保存備用。

圖1 石榴不同發育階段的不完全花（a）與完全花（b）Fig.1 Incomplete（a）and complete（b）flowers at different developmental stages of pomegranate（Punica granatum L.）

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 使用FGENESH 在線工具（http://www.softberry.com/）預測PgSPL2的基因結構與氨基酸序列。使用在線工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析序列基本特性。利用在線工具Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測其亞細胞定位。利用Pfam 網站（http://Pfam.sanger.ac.uk/）分析其保守結構域。使用在線工具PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）下載石榴、擬南芥、葡萄、番茄的基因組序列與gff 文件，使用TBtools 軟件將其翻譯為蛋白序列；使用Pfam 數據庫在線工具（http://pfam.xfam.org/）下載SBP（PF03110）保守結構域隱馬可夫模型文件（SBP.hmm）。基于SBP.hmm 文件，利用HMMER3.0 軟件分別在石榴、擬南芥、葡萄和番茄的蛋白質序列文件中搜索包含SBP 結構域的成員；運用MEGA7.0 軟件對序列進行進化分析并采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統進化發育樹，參數設置：Bootstrap method 1 000，其余采用默認值；利用Fig tree 軟件美化系統發育樹；使用DNAMAN 和WebLogo 分別對氨基酸序列進行多序列比對和可視化。

1.2.2 石榴PgSPL2的克隆 利用總RNA 提取試劑盒提取石榴葉片、籽粒、花和果皮的混合樣品中的總RNA，并合成cDNA 第一鏈，采用Oligo 7.0 軟件設計PgSPL2引物（表1）。使用高保真酶擴增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并送至上海生工測序，獲得石榴PgSPL2的CDS 序列，利用ExPaSy-Translate 在線工具（https://web.expasy.org/translate/）將其翻譯為氨基酸序列。

1.2.3 生長調節劑對石榴完全花成花率及花期的影響 采用人工統計方法，掛牌編號標記的處理植株，記錄花期；于石榴盛花期記錄單株開花數和完全花數，計算完全花比率：

完全花成花率（%）=完全花數/單株開花數×100%。

1.2.4 石榴PgSPL2在不同組織中及不同處理條件下的表達分析 依據克隆的PgSPL2核酸序列，設計實時熒光定量PCR 引物，并以石榴PgAction為內參（表1）。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測不同生長調節劑處理下石榴完全花、不完全花在不同時期PgSPL2的表達量，以P1 階段的表達量為標準；以未處理的石榴新葉、花蕾、嫩莖、果肉的cDNA 為模板，利用RT-qPCR 檢測PgSPL2在石榴不同組織中的表達模式，熒光染料為The BioEasy Master Mix Plus（SYBR Green），反應程序為95℃ 3 min；95℃ 30 s；60℃ 15 s；72℃ 20 s，40 個循環。3 次生物學重復，使用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.5 農桿菌介導的擬南芥轉化 構建帶有GUS 標簽的pBI121-GUS-PgSPL2表達載體（表1），轉入農桿菌GV3101，按1∶100 的比例將活化后的農桿菌接種于50 mL 的LB 液體培養基中，28℃ 210 r/min振蕩培養16 h，然后4 000 r/min 離心10 min，收菌，采用滲透液（0.05% sliwet77+5%蔗糖+1/2 MS 培養基）重懸菌體后，沾花法轉化擬南芥。侵染后的擬南芥植株用保鮮袋罩住，每隔一周侵染1 次，共3 次，待收獲時，收集成熟的擬南芥種子。將第一次侵染后收獲的擬南芥種子消毒后種在1/2 MS 固體培養基上，當第一對真葉展開且生根后進行移栽（泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶2∶1），置于培養箱中培養鑒定，待T1擬南芥植株成熟后進行DNA 鑒定，重復上述步驟，選取T2幼苗種植2-3 周后選擇成活的擬南芥幼苗觀察表型，采集T2種子培養基篩選后選取部分幼苗進行GUS 染色，待植株成熟后采集野生型與T3轉基因擬南芥的花序與葉片提取RNA、反轉錄，進行RT-qPCR 熒光定量分析。

表1 基因克隆、功能驗證以及特異性表達分析引物表Table 1 Primers for the gene cloning，functional verification and specific expressions

2 結果

2.1 石榴PgSPL2生物信息學分析

對PgSPL2進行理化特性分析，編碼產物分子式為C915H1486N308O301S10，分子量為21 938.35 kD，脂溶指數為44.85，總平均親水指數為-1.176，理論等電點（pI）為9.16，不穩定系數為70.9。PlantmPLoc 預測其定位于細胞核上。Pfam 數據庫檢索發現該蛋白具有SBP 保守結構域。系統進化樹結果（圖2）顯示，石榴PgSPL2 與擬南芥AtSPL3、AtSPL4、AtSPL5 聚在同一分支上，表明其親緣關系較近。將與PgSPL2 同一分支的蛋白進行多重比對，結果顯示（圖3），PgSPL2 具有高度保守的SBP 結構域，該結構域由76 個氨基酸構成，包含2 個鋅指結構Cys-Cys-Cys-His（C3H）、Cys-Cys-His-Cys（C2HC）和1 個核定位信號（NLS）。

圖2 石榴、擬南芥、番茄和葡萄SPL 系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of SPL proteins in Pomegranate，Arabidopsis，Solanum lycopersicum and Vitis vinifera

圖3 蛋白多重序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of protein

2.2 石榴PgSPL2的克隆

提取石榴葉片、籽粒、花和果皮混樣組織中的總RNA，反轉錄成cDNA，使用PgSPL2的特異引物（表1）進行擴增，獲得與預期目標片段一致的單一條帶（圖4）。測序獲得PgSPL2的編碼區序列，長度為591 bp，編碼196 個氨基酸，該基因含有完整的SBP 保守結構域（圖5）。

圖4 石榴PgSPL2 的PCR 擴增Fig.4 PCR amplification of PgSPL2 in pomegranate

圖5 PgSPL2 的CDS 序列及其編碼氨基酸序列Fig.5 CDS sequence and deduced amino acid sequence of PgSPL2 gene

2.3 生長調節劑對石榴完全花成花率及花期的影響

分析不同生長調節劑對石榴花期的影響（表2），結果顯示，噴施生長調節劑后初花期延遲3-5 d，盛花期延遲2-4 d，花末期提前3-5 d。

表2 生長調節劑對石榴花期的影響Table 2 Effects of growth regulators on pomegranate flower stage

分析不同生長調節劑對石榴完全花成花率的影響（表3），結果顯示，噴施生長調節劑后能顯著增加石榴完全花比率。與CK 相比，噴施PP333 后，完全花成花率增加了7.53%；噴施6-BA 后，完全花成花率增加了4.79%；噴施IBA 后，完全花成花率增加了4.40%。

表3 生長調節劑對石榴完全花成花率的影響Table 3 Effects of growth regulators on complete flowering rate of pomegranate

2.4 石榴不同組織中及不同處理后PgSPL2的表達分析

采集石榴不同組織進行qPCR 檢測（圖6-A），發現PgSPL2在各個組織中均有表達，在果肉中表達量最高，其次是花蕾，在葉片和嫩莖中表達量最低。

PP333 處理后，與對照CK 相比，不完全花中PgSPL2在P2、P3 階段均上調，完全花中PgSPL2表達量均顯著下調（圖6-B）；6-BA 處理后，不完全花中PgSPL2在P2、P3 階段表達量差異不大，完全花中，PgSPL2在P2 階段表達量顯著上調，P3 階段表達量顯著下調（圖6-C）；IBA 處理后，不完全花中PgSPL2在P2、P3 階段均有所上調，完全花中PgSPL2表達量均顯著下調（圖6-D）。

圖6 PgSPL2 在石榴不同組織及不同處理后不同發育階段的相對表達量Fig.6 Relative expressions of PgSPL2 gene in different tissues of pomegranate and at different developmental stages after different treatments

2.5 轉基因擬南芥的鑒定

將T0轉基因擬南芥種子種植在含卡那霉素的培養基中，能夠正常生根和展出真葉，初步篩出轉基因植株（圖7-A）。移栽，待植株成熟后，分別提取T1轉基因植株DNA 進行檢測，得到與預期結果一致的目的片段（圖7-B），鑒定為陽性單株。繼續重復上述步驟，篩選出T2植株（圖7-C），開花期選擇長勢一致的野生型對照及轉基因植株（圖7-D）進行觀察，與野生型植株相比，發現過量表達PgSPL2擬南芥植株蓮座數、葉片數和莖粗明顯較弱，并出現早花現象。收集T2轉基因擬南芥種子，種植后，進行GUS 染色拍照（圖7-E），發現轉基因擬南芥的根和莖上均出現藍色。為了進一步增強基因轉化在花中的遺傳穩定性，獲得轉基因純合株系，繼續篩選下一代，采取T3轉基因擬南芥花序進行GUS 染色拍照（圖7-F），發現PgSPL2轉基因擬南芥的花瓣和雄蕊上均出現藍色。

圖7 PgSPL2 轉基因植株的檢測與表型Fig.7 Detection and performance observation of the PgSPL2 transgenic plants

為進一步研究PgSPL2對花發育的作用，通過RT-qPCR 分析PgSPL2與其下游相關基因AtFUL、AtLFY及AtSOC1之間的關系。結果（圖8）表明，過表達轉基因植株中，PgSPL2的表達量在花序、葉中均顯著高于野生型（圖8-A），其下游基因AtFUL、AtLFY及AtSOC1在花序、葉中的表達量均顯著高于野生型。

圖8 PgSPL2 轉基因植株與下游相關基因的表達量Fig.8 PgSPL2 transgenic plants and downstream associated gene expressions

3 討論

在植物生長發育過程中，越來越多的SPL 轉錄因子被挖掘，其在開花時間調控過程中是一個重要的樞紐，SPL 通過激活下游花分生特異組織LFY、FUL和AP1，促進開花誘導，促進植物營養生長向生殖生長過程的轉變［20］。本研究從石榴中分離出一個與花發育相關的SPL 基因PgSPL2。生物信息學分析表明，PgSPL2 編碼196 個氨基酸，亞細胞定位在細胞核，含有2 個鋅指結構和1 個核定位信號的SBP 高度保守結構域，第二個鋅指結構和核定位信號有部分重疊區域，可以引導SBP-box進入細胞核調控下游基因的轉錄表達［21］。系統發育樹表明，PgSPL2和擬南芥AtSPL3、AtSPL4、AtSPL5聚成一簇，AtSPL3/AtSPL4/AtSPL5在擬南芥幼年期向成年期的轉變中起重要作用，能促進花分生組織特異基因的表達，促使擬南芥提前開花［22］，暗示著PgSPL2與其同源基因可能具有相似的功能。

通過組織特異表達分析發現，PgSPL2在石榴不同組織均有表達，且在花和果肉中表達量遠高于葉片與嫩莖，說明其在花果發育中可能起到非常重要的作用［23］。為了進一步說明PgSPL2在成花過程中的作用，本研究分析了石榴不完全花、完全花在不同發育階段PgSPL2的表達情況，并用生長調節劑PP333［24］、6-BA［25］、IBA［26］進行處理。結果表明，與對照相比，石榴初花期、盛花期均有所推遲且完全花比率提高；噴施生長調節劑后，不完全花中PgSPL2含量高于完全花中的含量。這可能是因為作為擬南芥AtSPL3/AtSPL4/AtSPL5的同源基因，PgSPL2可能同樣具有促進早花這一作用，石榴花芽分化時營養物質積累不足，不能及時供給花芽分化［27］，因此，不完全花中該基因表達量較高；當噴施生長調劑后石榴花期延遲，有利于營養物質積累，提供給花的生長發育，促進雌花的形成［28］，PgSPL2表達量在完全花生長后期降低，完全花比率顯著提高。各處理完全花各時期PgSPL2表達量都有所降低，除了6-BA 處理下，PgSPL2在完全花敗育關鍵期含量高于不完全花，這可能由于PgSPL2功能冗余，也可能因為SPL 基因家族成員較多，有其他基因進一步參與調節6-BA 信號來響應花器官發育。

通過沾花法轉化PgSPL2擬南芥植株出現早花現象，表明PgSPL2可能起著調節開花時間的作用。GUS 染色轉基因擬南芥幼苗后，在其莖和葉上出現不同程度及范圍的藍色，轉基因擬南芥長大后，采集花序進行GUS 染色，在其花序及雄蕊上出現不同程度及范圍的藍色，表明PgSPL2在莖、葉和花上具有活性。通過RT-qPCR 分析發現，轉基因PgSPL2擬南芥后其花序、葉中基因表達量顯著高于野生型擬南芥，下游相關基因AtFUL、AtLFY及AtSOC1表達量都顯著提高，這可能是因為PgSPL2與擬南芥AtSPL3/AtSPL4/AtSPL5是同源基因，LFY是AtSPL3的直接下游靶基因，過量表達AtSPL3可以顯著提高LFY的表達水平，AtSPL3/AtSPL4/AtSPL5會識別下游的花分生組織關鍵基因AtAP1、AtFUL、AtLFY啟動子區，調控這些基因的表達，從而促進擬南芥開花［29］。因此，在石榴生產中可通過噴施生長調劑或其他措施，降低PgSPL2的表達量，延遲花期，使花期避過春季倒春寒和連陰雨，使花芽正常分化，提高石榴的經濟效益。

4 結論

從‘突尼斯’軟籽石榴中克隆得到了PgSPL2基因，其具有高度保守的SBP 結構域。該基因轉化擬南芥后發現其花序下游調控基因表達量顯著提高，使擬南芥提前開花。生長調節劑噴施處理石榴后，花期延遲，花組織中PgSPL2基因表達量顯著下調，因此該基因在石榴中參與開花時間的調控。