新型冠狀病毒核蛋白N端結構域的表達純化以及晶體優化

陳鐸 劉永哲

（1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院呼吸與危重癥醫學科，北京 100020；2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院感染和臨床微生物科，北京 100020）

自2019年12月新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）爆發以來，對全球的經濟社會造成了重大的影響，根據美國霍普金斯大學的統計，截至目前已經超過4.7 億人次感染新型冠狀病毒，超過600 萬人死于新冠肺炎感染［1-2］。面對日益增長的新型冠狀病毒感染病例，高效的檢測手段和有效的抗體治療是應對新型冠狀病毒的重中之重。

SARS-CoV-2 是目前發現的基因組較大的正鏈RNA 病毒，基因組大小約為30 kb，其5′端的基因主要編碼冠狀病毒的16 個非結構蛋白［3-5］。基因組3′端編碼冠狀病毒的4 種結構蛋白，包括核蛋白（nucleocapsid，N）、表面刺突蛋白（spike，S）、小包膜蛋白（envelope，E）和外膜蛋白（membrane，M）［6-8］。N 蛋白是冠狀病毒中含量最高的結構蛋白，位于病毒內部，具有較高的保守性。冠狀病毒N 蛋白包含了N 端結構域和C 端結構域，是一種具有較高免疫原性的磷酸化蛋白，在病毒內部與病毒RNA結合形成螺旋衣殼，穩定病毒的基因組［9-13］。因此，N 蛋白是重要的冠狀病毒檢測靶點，同時也是關鍵的抗體開發靶點蛋白。

雖然新型冠狀病毒的N 蛋白非常重要，但由于其蛋白中間存在柔性部分，全長蛋白并不穩定［14-15］。為了便于N 蛋白的結構生物研究和后續的抗體開發，本研究分析了N 蛋白全長的氨基酸序列，選取N 蛋白序列中的N 端結構域，約12 kD 的核酸結合序列作為靶蛋白，構建原核的表達質粒，在大腸桿菌中誘導表達新型冠狀病毒N 蛋白N 端結構域重組蛋白，N2+親和層析和分子篩凝膠層析探索N蛋白N 端結構域的純化方式從而獲得較高純度的目的蛋白，通過Hampton 晶體試劑盒優化得到質量較高的N 蛋白N 端結構域蛋白質晶體，為后續N 蛋白N 端結構域的結構生物學研究和抗體制備提供關鍵研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pET28b 原核表達質粒由本實驗室保存；N-N 蛋白（N 蛋白N 端結構域（47N-175G））基因由北京睿博生物科技有限公司進行優化合成；大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）和質粒擴增菌株DH5α 購自北京全式金生物技術有限公司；卡那霉素、DTT 和IPTG誘導劑購自大連美侖生物技術有限公司；酵母粉和蛋白胨購自OXOID 公司；鹽酸、氯化鈉和咪唑購自北京化工廠；HEPES 和六水氯化鎂購自Amresco公司；DNA 膠回收試劑盒和小提質粒試劑盒購自杭州博日科技有限公司；SDS-PAGE 預制膠和Ni-NTA beads 購自南京金斯瑞生物科技有限公司；T4 連接酶和PCR mix 酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內切酶購自Thermo Fisher 公司；晶體篩選試劑盒購自Hampton 公司；16 孔晶體板購自天宇有機玻璃制品高分子有限公司；考馬斯亮藍R250 和G250 購自北京溪洋匯智科技有限公司；10 kD 超濾濃縮管（15 mL 和5 mL）購自Merck Millipore 公司；Superdex 75 10/30 GL 購自GE 公司。

1.2 方法

1.2.1 N-N 蛋白的序列合成和表達載體構建 通過NCBI 數據庫查詢新型冠狀病毒N 蛋白全長氨基酸序列（GenBank：MN908947.3），本實驗使用CLUSTALW 網站進行氨基酸序列對比，選取N-N 蛋白（47N-175G）129 個氨基酸相對應的基因序列為目的序列，經北京睿博生物科技有限公司進行原核系統密碼子優化并人工合成，N-N 蛋白的基因序列連入通用載體Topo。我們以Topo-N-N 為模板，N-N-F和N-N-R 為引物（表1），擴增新型冠狀病毒N 蛋白N 端結構域基因序列。擴增目的基因片段通過DNA膠回收試劑盒進行片段回收，之后和質粒pET28b分別通過雙酶切（NdeI 和XhoI）、T4 連接酶進行片段載體連接和轉化進入DH5α 感受態進行質粒擴增，培養皿挑選陽性單克隆并通過小提質粒試劑盒進行質粒提取，雙酶切和測序鑒定正確的重組目的質粒命名為pET28b-N-N。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 N-N 蛋白誘導表達 將構建好的pET28b-N-N質粒轉化到大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）感受態細胞中。通過卡那霉素抗性平板篩選陽性的表達菌株，轉移至包含5 mL LB 培養基的小試管中并添加50 μg/mL 卡那霉素進行37℃ 220 r/min 過夜搖晃培養。第2 天將菌株轉入包含1 L LB 培養基的大瓶中并添加50 μg/mL 卡那霉素進行220 r/min 搖晃培養至菌液OD600nm為0.8 時，降低培養溫度至16℃，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG 進行過夜誘導，之后將菌液進行4 000 r/min 離心收集大腸桿菌，然后用lysis buffer（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2）重懸并進行高壓均質破碎，12 000 r/min 離心后收集上清液進行后續的純化。

1.2.3 N-N 蛋白表達和純化 大量誘導表達N-N 蛋白，誘導結束后離心、收集大腸桿菌，重懸高壓均質破碎，高速離心獲得含有大量目的蛋白的上清液，然后進行Ni2+親和層析純化，上樣流速為1 mL/min，上樣后用wash buffer（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2，20 mmol/L 咪唑）進行洗雜至G250 檢測不變藍，最后用Elution buffer（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2，200 mmol/L 咪唑）洗脫目的蛋白并收集流出液。我們將流出液經過超濾濃縮管（截留蛋白分子量：10 kD）濃縮至1 mL，以1 mL/min 的流速上樣，進行分子篩凝膠色譜層析（Superdex 75），收集最要的蛋白質峰，即為新型冠狀病毒N-N 蛋白。通過SDS-PAGE 電泳對其進行純度檢測。

1.2.4 N-N 蛋白與RNA 相互作用的EMSA 分析 通過EMSA 試驗驗證N-N 蛋白與核酸的相互作用。采用體積分數為10%的Native 蛋白膠，合成序列為UCUUAGGAGAAUGAC 的RNA，按N-N 蛋白和RNA 摩爾比為1∶1.2 的比例預混蛋白和核酸，加上等比例的甘油，冰上孵育2 h 后上樣，冰浴電泳（7 mA，120 min）。結束后將蛋白膠放置到含有核酸染料的染液中染色10 min，在照膠儀上觀察條帶。

1.2.5 N-N 蛋白晶體優化 將分子篩純化的N-N 蛋白峰進行合并，經過超濾濃縮管（截留蛋白分子量：10 kD）濃縮至7 mg/mL 左右進行懸滴晶體生長條件篩選。晶體生長溫度為16℃，試劑條件包括Hampton 公司的index1-96、PEGRx 1、PEGRx 2、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等試劑盒。最終在PEG/Ion Screen的23 號條件（0.2 mol/L Ammonium formate，20%W/V Polyethlene glycol 3350）初篩獲得N-N 蛋白質晶體，以此條件為基礎，進行晶體生長條件優化。優化手段包括以PEG/Ion Screen 的23 號條件為基礎，按4∶1 的體積比分別加入index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等其他晶體篩選試劑，獲得較大晶體后再進行Additive Screen 和Detergent Screen 最終優化。

2 結果

2.1 N-N蛋白的序列選取

使用CLUSTALW 網站對SARS-CoV-2（QHD 43423.2）、SARS-CoV（NP_828858.1）和MERS-CoV（YP_009047211.1）進行N 蛋白氨基酸序列對比，可以看出在N 蛋白的N 端結構域3 種病毒的差異較大，特別是MERS-CoV 與其他兩種病毒的差異更大（圖1），因此本研究選取了新型冠狀病毒N-N 蛋白（47N-175G）129 個氨基酸序列作為目的蛋白序列，并在NCBI 查找對應的基因序列，通過生物公司進行基因合成構建原核表達重組載體，通過原核表達純化獲得性質較好特異性較高的N-N 蛋白。

圖1 SARS-CoV-2、SARS-CoV 和MERS-CoV 的N 蛋白氨基酸序列對比Fig.1 Comparison of N protein amino acid sequences of SARS-CoV-2，SARS-CoV and MERS-CoV

2.2 N-N蛋白表達質粒的構建和鑒定

以Topo-N-N 為模板，生物公司合成N-N-F 和N-N-R 進行擴增，獲得大小約350 bp 的目的基因片段，與預期的大小相符（圖2），通過NdeI 和XhoI雙酶切目的片段和載體，T4 連接酶22℃連接2 h 轉化到DH5α 感受態中，通過帶卡那霉素抗性的板子篩選獲得陽性克隆，再通過雙酶切鑒定和基因測序鑒定，獲得pET28b-N-N 重組原核表達質粒。

圖2 N-N 蛋白基因片段擴增結果Fig.2 PCR amplification result of N-N protein

2.3 N-N蛋白的純化

將pET28b-N-N 質粒轉化到大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）中，按照1.2.2 中的方法培養誘導N-N 蛋白的大量表達，采用Ni2+親和層析柱和分子篩凝膠色75 譜層析柱純化N-N 蛋白。N-N 蛋白在Superdex 75 分子篩中的出峰位置為16.5 mL，符合Superdex 75 分子篩的出峰情況，其峰尖280 nm 的吸收值約為260 nm 的2 倍為正常的蛋白質比值（圖3-A），通過12% SDS-PAGE 蛋白質膠分析N-N 的純化情況，經過Ni2+親和層析柱和分子篩凝膠色譜層析柱的純化，通過Quantity One 軟件對蛋白膠進行積分定量分析，N-N 蛋白的純度達到90%以上（圖3-B）。

圖3 N-N 蛋白的表達純化Fig.3 Expression and purification of N-N protein

2.4 EMSA試驗驗證N-N蛋白與RNA相互作用

通過EMSA 試驗證明了N-N 蛋白與RNA 確實具有較強的相互作用（圖4），隨著N-N 蛋白濃度的提高，可以形成穩定分N-N 蛋白-RNA 復合物。進一步明確N-N 蛋白結合RNA 的能力，從側面驗證N蛋白N 端結構域結合病毒基因組，穩定病毒基因組的功能。但是EMSA 無法準確定量N-N 蛋白與RNA的結合比例以及N-N 蛋白與RNA 結合的具體方式，這些將在后續實驗中通過完整的N-N 蛋白-RNA 復合物結構來進一步驗證。

圖4 N-N 蛋白與RNA 結合的EMSA 結果Fig.4 EMSA result of binding of N-N protein and RNA

2.5 N-N蛋白的晶體篩選

將分子篩純化的N-N 蛋白濃縮至7 mg/mL，加入2 mmol/L 的DTT 還原劑后進行晶體生長篩選。在PEG/Ion Screen 的23 號（0.2 mol/L Ammonium formate，20% Polyethlene glycol 3350 W/V）池液生長條件獲得初篩N-N 蛋白晶體（圖5-A）。以PEG/Ion Screen 的23 號條件為基礎，按照4∶1 的體積比分別加入index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等其他晶體篩選試劑，在添加Crystal Screen 的45 號（0.2 mol/L Zinc acetate dihvdrate，0.1 mol/L Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5，18% Polyethlene glycol 8000 W/V）獲得較大的晶體（圖5-B）。之后再進行Additive Screen 和Detergent Screen 優化，最終在添加Additive Screen 25 號（1.0 mol/L Sodium malonate pH 7.0）下獲得質量較高的N-N 蛋白晶體（圖5-C）。

圖5 N 蛋白的晶體優化Fig.5 Optimization of N protein crystal

3 討論

冠狀病毒包含4 種結構蛋白，N 蛋白是冠狀病毒最重要的結構蛋白之一［16］，負責穩定病毒的基因組，協助病毒的轉錄復制過程。此外，N 蛋白具有較強的免疫原性［17］，可以誘導人體產生較強的免疫應答［18］。N 蛋白的抗體較S 蛋白的抗體更早出現［19］，而且檢測率更高，維持時間更長，說明對于N 蛋白抗體檢測試劑盒的開發比S 蛋白更加有優勢［20-21］。由于N 蛋白全長序列中間存在柔性較大的部分，直接表達存在一定的困難［22］，為了獲得大量穩定的N蛋白，本研究通過構建N 蛋白N 端結構域的原核表達系統，獲得了大量的可溶N-N 蛋白，為后續抗體檢測試劑盒開發［23］和抗體藥物［24］開發提供重要的研究基礎。

本研究參考Chatzileontiadou 等［25］的蛋白純化方法，在獲得大量的可溶N-N 蛋白基礎上，通過Hampton 晶體試劑盒進行晶體篩選。但與既往的研究不同，根據初篩條件還需要進一步摸索條件，如上述結果中所述，既往大部分研究將分子篩純化的N-N 蛋白濃縮至7 mg/mL，加入2 mmol/L 的DTT 還原劑，本研究為進行多輪晶體優化，最終獲得質量較高的N-N 蛋白晶體，故以PEG/Ion Screen的23 號條件為基礎，按照4∶1 的體積比分別加入index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等其他晶體篩選試劑，在添加Crystal Screen 的45 號獲得較大的晶體，從而通過X 射線衍射試驗，獲得較好的衍射圖像。此步驟獲得的蛋白晶體，為N 蛋白N 端結構域三維結構的解析提供直接的研究基礎。為后續的N 蛋白結構生物學研究，以及N 蛋白穩定核酸機制的解釋提供了重要高純度蛋白。

本研究還通過EMSA 試驗定性驗證了N-N 蛋白與RNA 具有明確的相互作用。隨著N-N 蛋白濃度的提高，可以形成穩定分N-N 蛋白-RNA 復合物，該結果也被其他類似研究證實［26-29］。從側面證實了N蛋白N 端結構域在穩定病毒基因組中的作用，為后續的N 蛋白功能研究提供思路和依據。

N 蛋白主要兩大作用，一是結合在病毒的RNA，穩定病毒的基因組，二是可以結合轉錄復制形成N 蛋白的RNAP 復合物，促進基因組轉錄復制［30］。N 蛋白屬于結構蛋白，目前開發的抗體試劑盒也是針對N 蛋白或者S 蛋白［26-27］。本研究通過N-N蛋白的表達純化，主要是優化了后續的晶體生長條件，獲得質量較高的N-N 蛋白晶體，后續將以此為基礎解析N-N 蛋白晶體結構，為N 蛋白的結構生物學研究提供重要研究基礎。同時，N 蛋白具有較好的機體免疫原性，本研究提供了N 蛋白N 端結構域原核表達純化的方法，將為后續的抗體檢測試劑盒開發，以及靶點N 蛋白的抗體藥物研究提供關鍵的技術支撐。

4 結論

本研究提供了新型冠狀病毒N-N 蛋白表達純化的新方法，在大腸桿菌表達系統中高效的表達大量可溶N-N 蛋白。通過Ni2+親和層析和分子篩凝膠色譜層析可以獲得純度超過90%的N-N 蛋白。通過晶體篩選最終獲得質量較高的N-N 蛋白晶體，為后續的結構生物學研究提供重要理論基礎。