高效液相色譜法測定巧克力食品中7 種合成著色劑的研究

張海神，周瑞錚，莫淑梅

（東莞市食品藥品檢驗所，廣東東莞 523000）

隨著生活水平的提高，人們對食品的要求日趨嚴(yán)格，在充分注重安全性的前提下，也格外注重口感和外觀。合成色素因具有賦予食品色澤和改善食品色澤的特質(zhì)，在現(xiàn)代食品加工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[1]，但合成色素大多數(shù)對人體有害[2]，具有潛在的致泄性、臟器功能損害與致癌性。因此，我國國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中合成色素的最大使用量和檢出限做出了明確規(guī)定。目前，通用的合成色素檢測方法[3]主要有高效液相色譜法[4-6]、固相萃取-超高效液相色譜法[7-8]、全自動固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、紫外分光光度法[10]、電分析化學(xué)法[11]。在休閑食品中，巧克力食品因其獨特的口味廣受消費者喜愛，市面上巧克力制品種類繁多，國家標(biāo)準(zhǔn)雖然明確規(guī)定了巧克力制品的檢測方法，但在日常工作過程中發(fā)現(xiàn)，使用高效液相色譜法，按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.35—2016 檢測，檸檬黃和新紅兩色譜峰出峰時間過于緊密、分離度差、難以定量，不利于食品安全檢測工作進(jìn)行。基于國家標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化色譜條件同時測定巧克力食品中7 種合成色素，以期為實驗室測定合成色素提供參考意見。

1 試驗部分

1.1 材料

1.1.1 儀器

U-3000 型高效液相色譜儀，戴安公司產(chǎn)品；帶二級管陣列檢測器DAD；HWS-24 型電熱恒溫水浴鍋，泰斯特公司產(chǎn)品；純水儀，密理博公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），F(xiàn)isher 公司提供；0.02 mol/L 乙酸銨溶液；聚酰胺粉；純水（為GB/T 6682 規(guī)定的一級水）。

1.2 試驗步驟

1.2.1 樣品預(yù)處理

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測定》[12]進(jìn)行樣品前處理。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將上述7 種標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用移液管稀釋成0.5，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 質(zhì)量濃度工作梯度。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化對比

優(yōu)化國標(biāo)色譜條件，在波長為254 nm 條件下，高效液相色譜儀分析，二極管陣列器檢測，甲醇+乙腈（1∶1）和0.02 mol/L 乙酸銨溶液梯度洗脫，外標(biāo)法定量。

國標(biāo)方法與改進(jìn)方法對比見表1。

表1 國標(biāo)方法與改進(jìn)方法對比

2.2 儀器條件

色譜柱型號：C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL；二極管陣列檢測器，波長254 nm；流動相A 為甲醇，流動相B 為0.02 mol/L乙酸銨溶液，流動相D 為乙腈（甲醇∶乙腈=1∶1）；流速為1.0 mL/min。

梯度洗脫條件見表2。

2.3 色譜圖

7 種合成色素色譜條件優(yōu)化后圖譜（波長254 nm）見圖2。

圖2 7 種合成色素色譜條件優(yōu)化后圖譜（波長254 nm）

優(yōu)化前檸檬黃和新紅兩色譜峰的保留時間差為0.21 min，優(yōu)化后的保留時間差為0.28 min。表明此優(yōu)化方式能夠有效分離檸檬黃和新紅，減少兩峰黏連，同時其他5 種色素分離效果較好。

2.4 線性方程和檢出限

2.4.1 線性方程

以響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)做工作曲線。

7 種合成色素的保留時間、線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 7 種合成色素的保留時間、線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)

由表3 可知，質(zhì)量濃度為0.5～20.0 μg/mL 時，7 種合成色素相關(guān)系數(shù)為0.999 8～0.999 9，線性關(guān)系好。

2.4.2 方法檢出限

取曲線低點進(jìn)行測試10 次，取其信噪比，3 倍信噪比計算檢出限，10 倍信噪比計算定量限見表4。

7 種合成色素的優(yōu)化方法定量限、檢出限和國標(biāo)檢出限見表4。

表4 7 種合成色素的優(yōu)化方法定量限、檢出限和國標(biāo)檢出限

由表4 可知，在吸收波長為254 nm 時，所測得檢出限均低于標(biāo)準(zhǔn)要求的檢出限，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

按照檢出限低點，曲線的中點和高點或指標(biāo)限量值進(jìn)行加標(biāo)，同樣品一起前處理、測試，分3 個水平加標(biāo)（即低點加標(biāo)、中點加標(biāo)、高點加標(biāo)），每個水平重復(fù)測量6 次。

加標(biāo)回收率和精密度見表5。

表5 加標(biāo)回收率和精密度

由表5 可知，7 種不同色素的回收率為86.9%～98.3%，變異系數(shù)為0.5%～2.1%，均符合國家檢測標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)語

按照GB 5009.35—2016 國家標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜法檢測食品中合成色素，在實際工作中易出現(xiàn)檸檬黃和新紅兩色譜峰黏連現(xiàn)象，不易于工作進(jìn)行。經(jīng)過色譜條件的優(yōu)化，巧克力產(chǎn)品中的7 種合成色素可以有效分離。色譜條件的優(yōu)化可通過改變流動相溶劑組成和配比實現(xiàn)，參考朱彭玲梯度洗脫[13]，此改進(jìn)方法通過增加溶劑乙腈增加流動相A 溶劑的極性，擴大流動相間的極性差，使每個流出的組分都有合適的容量因子，改善峰型，提高分離能力，實現(xiàn)各組分最佳分離。改進(jìn)方法中采用甲醇+乙腈（1∶1）比例混合，在實現(xiàn)各組分充分分離條件下，既可以最大限度節(jié)約成本和降低色譜柱壓力，又在一定程度上有效降低檢測成本和儀器維護(hù)成本。優(yōu)化方法檢測巧克力食品中7 種合成色素分離效果良好，檢出限、加標(biāo)回收率和精密度均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求，在同類研究中，李媛媛等人[14]曾在高效液相色譜法同時測定食品中多種合成色素的方法探究一文中以0.02 mol/L 乙酸銨溶液和甲醇+乙腈（3∶1）為流動相使各組分有效分離，方法加標(biāo)回收率為92.0%～99.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～1.4%，均優(yōu)于改進(jìn)方法的試驗結(jié)果，但該改進(jìn)方法使用的甲醇少，具有降低色譜柱壓力、延長色譜柱使用壽命的優(yōu)點，另結(jié)果存在差異的原因主要在于試驗樣品基質(zhì)本底不同和試驗前處理方法不同，故此改進(jìn)方法可從這2 個方面繼續(xù)優(yōu)化改進(jìn)。

采用優(yōu)化后的色譜條件測定巧克力食品中7 種合成色素，能夠有效分離7 種色譜峰，有利于企業(yè)開展檢測工作，提高實驗室檢測效率，從而能給相關(guān)實驗室提供參考作用。