高效液相色譜-串聯質譜法快速測定雞蛋中的甲硝唑

張金磊，邢麗杰，羅瑞峰，張 飛，陳永發，鞏婧婷，賀玉鳳

（新疆農墾科學院分析測試中心，新疆石河子 832000）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，雞蛋作為日常膳食中蛋白質主要來源，越來越有著不可替代的作用[1]。甲硝唑是人工合成硝基咪唑類藥物，對家禽的滴蟲病感染、腸道的厭氧菌感染、生殖系統疾病等有著很好的療效[2-3]。因而常作為驅蟲藥添加在飼料中，并且可用于改善飼料轉化率。如果養殖過程中用藥不規范，沒有遵守休藥期，甲硝唑加入飼料中，容易造成動物源性食品中甲硝唑的殘留[4]。然而甲硝唑對人體有多種毒副作用，尤其具有潛在致癌性和致遺傳變異作用[5-6]，且甲硝唑進入人體后能快速分布于全身，因此對雞蛋中甲硝唑的殘留檢驗非常必要。

歐盟在1998 年規定甲硝唑在食品動物體中不得檢出，在2019 年，我國發布的GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中規定，甲硝唑藥物允許作為治療動物疾病使用，并且在動物源性食品中不得檢出[7]。目前，甲硝唑殘留檢測的方法主要包括液相色譜法[8]、液相色譜串聯質譜法[9-11]等。但是針對動物肌肉組織中的甲硝唑殘留檢測方法研究較多，雞蛋液體基質比肌肉固體組織復雜。現行國標方法對雞蛋中甲硝唑殘留檢測分析較少[12]；同時，前處理方法復雜繁瑣，不利于大批量檢測。因此，通過對雞蛋中甲硝唑的提取、凈化及流動相組成等因素的優化，建立了高效液相色譜串聯質譜快速檢測雞蛋中甲硝唑的方法，該方法靈敏度高、準確性好、快速、高效，適用于雞蛋中甲硝唑殘留的篩查和測定。

1 試驗部分

1.1 試劑與材料

甲醇、乙腈、甲酸（HPLC 級），德國CNW 公司提供；甲硝唑（純度大于99.0%），德國Dr.Ehrenstorfer 公司提供；超純水；雞蛋，購自當地不同超市、農貿市場和生產基地，去殼，經勻漿（10 000 r/min）后，置于-20 ℃下冷凍保存備用。

1.2 儀器設備

Agilent 1200+6460 型高效液相色譜串聯質譜儀，美國Agilent 公司產品；MS3 basic 型漩渦混合器，德國IKA 公司產品；Sigma 3-30k 型高速冷凍離心機，德國Sigma 公司產品；KQ-600DE 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；IQ7000 型超純水儀，美國Milli-Q 公司產品。

1.3 UPLC-MS/MS 檢測條件

色譜條件：ZORBAX SB-Aq Solvent Saver Plus（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）色譜柱，色譜柱溫度30 ℃，流動相組成：水-甲醇（梯度），進樣量5 μL，流速0.6 mL/min，梯度洗脫。

以水-甲醇為流動相的梯度洗脫程序見表1。

表1 以水-甲醇為流動相的梯度洗脫程序

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；質譜掃描方式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓4 000 V，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速10 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min。

甲硝唑的質譜參數見表2。

表2 甲硝唑的質譜參數

1.4 樣品前處理

稱取經勻漿后的雞蛋2.00 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入0.2%甲酸乙腈溶液10 mL，渦旋振蕩混勻1 min，30 ℃下恒溫超聲提取30 min；以轉速10 000 r/min 離心5 min，取上清液5 mL 直接加入到PRiME HLB 固相萃取小柱上，無需活化，控制流速在3～4 mL/min，收集全部流出液。于40 ℃下氮吹至近干，用0.1%甲酸水+甲醇（90+10）溶液定容至2 mL，渦旋混勻后過0.22 μm 有機微孔濾膜，供HPLC-MS/MS 法測定。

1.5 標準溶液的配制

準確稱取甲硝唑標準品25 mg，用甲醇溶于25 mL容量瓶中，配制成質量濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備溶液，置于-20 ℃下避光保存。準確移取0.025 mL標準儲備液至25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配置成1 μg/mL 的標準中間溶液，用基質空白溶液將中間液逐級稀釋，配制成2，4，10，20，30，40 ng/mL的甲硝唑系列工作溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，供高效液相串聯質譜儀檢測。

2 結果與分析

2.1 質譜和色譜條件的優化

2.1.1 質譜條件的優化

在電噴霧電離和多反應監測模式下，對100 ng/mL甲硝唑標準溶液多次注射進樣，通過對鞘氣溫度、鞘氣流速，毛細管電壓、碰撞電壓、碰撞能量等質譜參數進行優化。選擇穩定性好、豐度高和干擾小的2 個碎片離子作為甲硝唑定量離子和定性離子，并以豐度最強、響應值最高的離子對作為定量離子對。

甲硝唑的MRM 離子對質譜圖見圖1。

圖1 甲硝唑的MRM 離子對質譜圖

2.1.2 色譜條件的優化

通過比較水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇4 種流動相體系對甲硝唑響應值的影響。結果發現，當流動相為水-甲醇體系，甲硝唑的響應較高。因此，選用水-甲醇體系作為檢測雞蛋中甲硝唑的流動相。

不同流動相體系對甲硝唑提取效率的影響見圖2。

圖2 不同流動相體系對甲硝唑提取效率的影響

2.2 提取條件的選擇與優化

甲硝唑屬于硝基咪唑類藥物，微溶于乙醇和水，在乙酸乙酯和乙腈中有較好的溶解性。雞蛋中有蛋白質、脂肪、水、磷脂等物質，由于乙酸乙酯和乙腈都可以較好地提取雞蛋中的甲硝唑，但是乙酸乙酯提取的雜質較多，且對儀器干擾較大。而乙腈作為提取溶劑，可以起到沉淀蛋白質的作用，可通過離心去除。但是大量的脂肪和磷脂類會和目標物一起提取出來，這些物質會干擾LC-MS 分析，污染液相系統。所以，試驗選擇用PRiME HLB 小柱對提取液進行凈化，PRiME HLB 小柱可有效去除提取液中大部分脂肪和磷脂類物質，從而達到凈化除雜的目的。

3 方法學評價

3.1 線性關系和檢出限

取6 份空白樣品，樣品經過前處理得到空白基質，取一定量的甲硝唑標準中間液，用空白基質稀釋成適當的濃度，配制成標準系列工作曲線。在優化后的前處理和儀器條件下，對一系列空白基質中添加的甲硝唑標準工作溶液進行測定，以定量離子峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標進行回歸分析。結果表明，甲硝唑在2～40 ng/mL 范圍內呈現良好的線性關系，線性相關系數R2=0.999 6。信噪比S/N 為3 時，計算甲硝唑的檢出限為0.5 μg/kg，信噪比S/N為10 時，計算甲硝唑的定量限為1 μg/kg。該方法線性關系良好、靈敏度高。

甲硝唑的線性方程、線性范圍、相關系數見表3。

表3 甲硝唑的線性方程、線性范圍、相關系數

3.2 回收率和精密度

選取空白雞蛋樣品，按照試驗方法進行3 個質量濃度水平添加回收率試驗，每個水平重復測定6 次。

甲硝唑的回收率和精密度見表4。

表4 甲硝唑的回收率和精密度

雞蛋中甲硝唑的平均回收率為83.2%～104.0%，相對標準偏差為0.8%～1.2%。說明該方法回收率和精密度良好。

雞蛋空白樣品添加質量濃度為5 ng/mL 的基質標見圖3，雞蛋空白樣品LC-MS/MS 譜圖見圖4，雞蛋樣品中添加量為4 μg/kg 的LC-MS/MS 譜圖見圖5。

圖3 雞蛋空白樣品添加質量濃度為5 ng/mL 的基質標

圖4 雞蛋空白樣品LC-MS/MS 譜圖

圖5 雞蛋樣品中添加量為4 μg/kg 的LC-MS/MS 譜圖

4 與標準比較

在SN/T 2624—2010《動物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測方法 液相色譜質譜/質譜法》標準方法中樣品提取凈化方法繁瑣、復雜，且步驟繁多。需要用到的試劑很多，并且提取試劑用量較大，凈化過程繁雜，需要多次轉移提取液，試驗的可操作性差、重現性較低、試驗耗時較長，不適用于大批量檢測。試驗試劑用量較少，固相萃取柱無需活化，大大提高了前處理速度，提高了檢測效率，適用于大批量的篩查和測定。

5 結論

采用ZORBAX SB-Aq 型色譜柱分離，優化了液相、質譜、提取及凈化等條件，提高了雞蛋中甲硝唑的提取和凈化效率，方法學驗證測定結果良好。表明該方法靈敏度高、準確性好，且高效、快速操作簡單，適于雞蛋中甲硝唑的快速篩查和測定。