番石榴多酚提取及其抗氧化作用與抑制α -葡萄糖苷酶活性研究

徐金瑞，侯方麗，胡 勇，黃建蓉

（廣東藥科大學食品科學學院，廣東中山 528458）

生物體內自由基過量堆積引發的氧化損傷，是導致生物衰老及誘發Ⅱ型糖尿病等相關代謝性疾病發生的主要原因之一。如果給予適當自由基清除劑及時清除體內多余的自由基，可以減少細胞的氧化損傷，從而預防或防止這些重大疾病的發生發展[1-3]。科學研究證實，植物組織內許多活性物質具有較好的抗氧化作用。α -葡萄糖苷酶可促進腸道食物中碳水化合物（如淀粉、蔗糖、麥芽糖等）分解成單糖，引起餐后血糖升高，如果α -葡萄糖苷酶活性被抑制或降低，可減緩葡萄糖的生成吸收，在一定程度上降低餐后血糖值。因此，臨床上常通過對α -葡萄糖苷酶活性抑制作用的檢測，初步判斷藥物有無降糖活性[4]。

番石榴是華南地區較為暢銷的水果之一，果實清甜可口，維生素、果糖、葡萄糖、谷氨酸、膳食纖維，以及鈣、磷、鐵等人體所需的微量元素含量豐富，是各種果蔬之冠，常吃番石榴具有抗衰老、調節生理機能、治療糖尿病、抗病毒、抗輻射等功效[5]。目前，有關番石榴果實的功效評價還較少，且多集中在化學成分方面的研究[6-9]。利用超聲波提取活性物質的過程中，由于物料受到超聲波的沖擊，再加上超聲波的空化作用，使得流體的相接觸面大大增加，從而強化了傳質過程。另外，超聲波被介質吸收后，轉化為熱能，進一步使得物料內部溫度升高，加速了多酚等有效成分的溶解，故而已在很多研究中被應用。

基于此，擬采用超聲波輔助萃取法優化番石榴中多酚物質的提取工藝，并對其體外清除自由基（DPPH·）和抑制α -葡萄糖苷酶的能力進行評價，可為番石榴及其產品的開發提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1）材料。番石榴洗凈、切片，于50 ℃下烘干，粉碎，過40 目篩，備用。

（2）主要試劑。三吡啶三吖嗪（TPTZ），Fluka公司提供；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Sigma 公司提供；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）和α -葡萄糖苷酶（1KU），北京索萊寶科技有限公司提供。

1.2 儀器設備

pHS-3C 型酸度計，上海精密科學儀器股份有限公司產品；V-1200 型紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產品；RE-2000 型旋轉濃縮蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品；FD-1E-80 型冷凍干燥機，上海楚定分析儀器有限公司產品；DFY-500 型高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司產品；SB25-12DT 型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚含量的測定-酒石酸亞鐵比色法[10]

吸取1 mL 待測樣液于25 mL 比色管中，加入4 mL 蒸餾水和5 mL 酒石酸亞鐵溶液，混合后，用pH 值7.5 磷酸鹽緩沖液定容，混勻；同時以蒸餾水代替樣品提取液作空白，于波長540 nm 處測定吸光度。另以0～50 μg/mL 的焦性沒食子酸標準溶液代替樣液制作標準曲線，得到回歸方程Y=2.669X-0.008 9，R2=0.999 5。

1.3.2 總抗氧化能力（TAC）測定[11]

實際加樣量擴大20 倍，即0.2 mL 樣品+0.6 mL水+6 mL 37 ℃的FRAP 工作液（10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L FeCl3、0.3 mmol/L 醋酸鈉緩沖液以1∶1∶10 的質量比混合），搖勻后放置4 min，于波長593 nm處測定吸光度。另以0.1～1.0 mmol/L FeSO4標準溶液代替樣品作標準曲線，得到回歸方程Y=0.311 7X-0.006，R2=0.999 4。樣品的總抗氧化能力以FeSO4提取物表示，單位mmol/g。

1.3.3 番石榴多酚提取工藝優化

（1）單因素試驗。①料液比的選擇，取1 g 樣品4 份，設置超聲波溫度50 ℃，提取時間20 min，60%乙醇作為溶劑，考查料液比1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL）對多酚含量和總抗氧化能力的影響。②乙醇體積分數的選擇，取1 g 樣品5 份，設置超聲波溫度50 ℃，提取時間20 min，料液比1∶40（g∶mL），考查乙醇體積分數40%，50%，60%，70%，80%對多酚含量和總抗氧化能力的影響。③超聲溫度的選擇，取1 g 樣品4 份，按料液比1∶40（g∶mL）加入70%乙醇溶液，提取時間20 min，考查溫度40，50，60，70 ℃對多酚含量和總抗氧化能力的影響。④提取時間的選擇，取1 g 樣品4 份，設置超聲波溫度50 ℃，按料液比1∶40（g∶mL）加入70%乙醇溶液，考查提取時間10，20，30，40 min 對多酚含量和總抗氧化能力的影響。

（2）正交試驗設計。在單因素試驗的基礎上，以多酚含量為考查指標，料液比、乙醇體積分數、溫度和超聲波作用時間等4 個因素作為自變量進行L9（34）正交試驗設計。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.3.4 番石榴多酚的制備

根據正交試驗優化方案，設置超聲溫度為50 ℃，按料液比1∶50（g∶mL）將適量番石榴粉加入60%乙醇溶液中，提取30 min，收集濾液，濃縮、冷凍、干燥，用于1.3.5 和1.3.6 試驗。

1.3.5 清除DPPH·的能力[12]

用無水乙醇作參比空白液，于0.2 mmol/L DPPH·溶液2 mL 中加入0～100mg/L 樣品2 mL，搖勻于室溫下放置30 min，于波長517 nm 處測定其吸光度A1，同時測2 mL 樣品與2 mL 無水乙醇反應后的吸光度A2，再測定0.2 mmol/L 的DPPH·溶液2 mL與無水乙醇2 mL 反應后的吸光度A3。根據以下公式計算樣品對DPPH·的抑制率：

式中：A1——DPPH·溶液與樣品溶液反應后的吸光度；

A2——樣品溶液與空白溶劑反應后的吸光度；

A3——DPPH·溶液與空白溶劑反應后的吸光度。

1.3.6 α -葡萄糖苷酶抑制試驗[13]

以0.1 mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 值6.8）為溶劑，分別配制1.0 U/mL α -葡萄糖苷酶溶液和1.0 mmol/L PNPG 溶液。將1.0 U/mL α -葡萄糖苷酶600 μL、pH 值6.8 磷酸鈉緩沖液200 μL，不同質量濃度（20～100 mg/L）番石榴多酚溶液200 μL 混勻后，于37 ℃下保持10 min，加入1.0 mmol/L PNPG 溶液200 μL，混勻后于37 ℃下保溫30 min，再加入0.5 mol/L Na2CO3溶液2 mL 終止反應，于波長400 nm 處測定濃度梯度番石榴多酚作用下的吸光度。

式中：A1——加番石榴多酚抑制劑和α -葡萄糖苷酶反應后的吸光度；

A2——只加番石榴多酚抑制劑不加α -葡萄糖苷酶的吸光度；

A3——不加番石榴多酚抑制劑只加α -葡萄糖苷酶反應后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 番石榴多酚提取單因素試驗

2.1.1 料液比對提取效果的影響

料液比對提取效果的影響見圖1。

圖1 料液比對提取效果的影響

從圖1 可以看出，隨著料液比逐漸加大，多酚含量和總抗氧化能力逐漸增大，且變化趨勢基本一致，推測番石榴多酚可能是其抗氧化的物質基礎之一。當料液比增至1∶40 后，多酚含量和總抗氧化能力增量趨于平緩，從成本考慮，料液比選擇1∶40比較適宜。

2.1.2 乙醇體積分數對提取效果的影響

乙醇體積分數對提取效果的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對提取效果的影響

從圖2 可以看出，隨著乙醇體積分數的增高，番石榴多酚含量和總抗氧化能力均表現出增大的趨勢，當乙醇體積分數增至70%時達到峰值，之后多酚含量和總抗氧化能力都相應下降，特別是總抗氧化能力下降趨勢明顯。可能是隨著乙醇體積分數的逐漸增高，提取體系的極性降低，此時番石榴中一些極性較小的成分也競相溶出，加上溶劑化及其熱效應的共同作用，造成多酚含量及其抗氧化能力降低。

通過對識字教學方式的對比，可以影射出教學方法背后教學目的的差異。教材編寫目標是不斷嬗變的。人教版語文教材的編寫理念依據課程標準（2001年版），“在語文學習過程中，培養愛國主義感情、社會主義道德品質，逐步形成積極的人生態度和正確的價值觀，提高文化品位和審美情趣”。[1]因此多通過傳統人文經典、祖國壯美山河、科技重大進步等話題編排識字材料，通過此類話題分支下的教學達到識字與培育民族向心力的雙重目的。

2.1.3 超聲溫度對提取效果的影響

超聲溫度對提取效果的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對提取效果的影響

從圖3 可以看出，隨著提取溫度的逐步升高，多酚含量和總抗氧化能力開始增大，但溫度升至50 ℃后，多酚含量和總抗氧化能力均呈下降趨勢，可能是溫度過高造成多酚類物質被破壞，同時較高濃度時乙醇溶液部分揮發所致。

2.1.4 提取時間對提取效果的影響

提取時間對提取效果的影響見圖4。

圖4 提取時間對提取效果的影響

從圖4 可以看出，在最初一段時間，隨著超聲波作用時間的不斷延長，多酚含量及抗氧化能力均表現出增大的趨勢，當超過30 min 后，多酚含量和總抗氧化能力的增量均趨于平緩，從節約能耗角度考慮，提取時間30 min 左右較為適宜。以往文獻資料中對活性物質采用常規方法提取時間較長，說明超聲波具有在短時間內明顯加速多酚類有效成分溶出的作用。

綜合上述研究結果可以發現，番石榴中多酚含量和總抗氧化能力變化趨勢一致，為了簡化研究，后續正交試驗中僅以多酚含量作為考查指標。

2.2 正交設計試驗

以多酚含量為考查指標，根據單因素試驗結果，對料液比、乙醇體積分數、超聲溫度和超聲時間等4 個因素按照L9（34）進行正交試驗。

表2 正交試驗設計及結果

根據表2 可優化得到超聲提取番石榴多酚的最佳因素水平組合為A2B2C2D3，即料液比1∶50，乙醇體積分數60%，提取溫度50℃，超聲時間30 min。通過比較極差值，各因素對提取效果的影響主次順序為C＞D＞B＞A，說明提取溫度對多酚提取的影響最大，其次分別是超聲時間，乙醇體積分數和料液比。由于最佳試驗組合并沒有出現在試驗方案中，進一步對最佳提取條件進行了驗證，測得的多酚含量為53.54 mg/g，均高于9 組方案的試驗結果，說明正交試驗所得最優條件合理可行。

2.3 對DPPH·的清除效果

番石榴多酚清除DPPH·的能力見圖5。

圖5 番石榴多酚清除DPPH·的能力

從圖5 可以看出，在0～100 mg/L 質量濃度范圍內，番石榴多酚提取物對DPPH·的清除能力逐漸增強，通過線性擬合得到回歸方程Y=0.875 8X+3.686 4，R2=0.979 2，將Y=50 代入可計算出IC50=52.88 mg/L。對比前期研究[10]得到的抗壞血酸IC50=46.76 mg/L，番石榴多酚清除DPPH·的能力稍弱于抗壞血酸，這可能與多酚純度較低有關，還需進一步純化后再做比較，但這一結果同時也說明了番石榴多酚清除自由基的能力較強，可以作為抗氧化活性資源來利用。

2.4 對α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用

番石榴多酚對α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用見圖6。

圖6 番石榴多酚對α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用

從圖6 可以看出，在0～10 mg/mL 質量濃度范圍內，番石榴多酚提取物對α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用隨著濃度增大逐漸增強，當質量濃度增大至8 mg/mL 后，抑制作用趨于平緩。通過線性擬合得到回歸方程Y=6.812 6X+2.5，R2=0.970 9，將Y=50 代入可計算出IC50=6.97 mg/mL。張鐘等人[14]在荔枝多糖抑制α -葡萄糖苷酶活性的研究中發現，40 mg/mL的阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率為69.23%。根據研究得到的回歸方程，可計算出同樣抑制率時番石榴多酚質量濃度僅為9.80 mg/mL，說明番石榴多酚對α -葡萄糖苷酶活性具有很強的抑制作用，可以作為α -葡萄糖苷酶抑制劑來開發。

3 結論

番石榴多酚的最佳提取工藝為料液比1∶50，乙醇體積分數60%，溫度50 ℃，超聲時間30 min。抗氧化和抑制α -葡萄糖苷酶活性試驗表明，番石榴多酚具有較強的清除DPPH·能力和抑制α -葡萄糖苷酶活性作用，說明番石榴多酚具有較強抗氧化作用，且是良好的α -葡萄糖苷酶抑制劑，表明番石榴多酚可作為抗氧化與降血糖功效因子加以開發利用。