固相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定兒童化妝品中新康唑等4種抗生素

汪 毅，聶明霞，賈 芳，梁文耀，李鑫宇，文嘉林，夏澤敏，譚建華

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家化妝品質(zhì)量檢驗檢測中心，廣東 廣州 511447）

近年來，關于兒童化妝品中激素、抗生素等藥物非法添加的報道頻出，兒童化妝品的質(zhì)量安全問題已成為大眾的關注焦點。相關研究表明，不規(guī)范使用抗生素類藥物容易造成過敏性皮炎、肝功能損傷等不良影響，并使人體產(chǎn)生耐藥性［1－3］，其中兒童是抗生素濫用中的最大受害者［4－6］。筆者在使用高分辨質(zhì)譜篩查化妝品中禁用物質(zhì)的日常工作中發(fā)現(xiàn)，市場上一些兒童化妝品（主要是嬰幼兒護膚膏）存在新康唑等抗生素非法添加情況。新康唑等并不在此前的一些化妝品相關規(guī)范和標準［7］規(guī)定的抗生素檢驗方法范圍內(nèi)，雖然目前一些藥物或土壤中此類化合物的測定方法已有文獻報道［8－9］，但化妝品與這些基質(zhì)差異較大，已有方法無法直接應用于化妝品中相關化合物的測定。因此亟需建立高靈敏、快速且能同時分析新康唑等多種組分的測定方法［10］，為相關監(jiān)管工作提供技術支撐。

液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術是抗生素分析檢測的有效技術手段［11－13］，但由于許多樣品在分析過程中存在基質(zhì)抑制現(xiàn)象，因此需要進一步凈化。新康唑、硫康唑、抑霉唑、噻康唑是咪唑類衍生物［14］，脂溶性較強，且此類化合物咪唑環(huán)上的吡啶N堿性較強，因此本文使用強陽離子交換SPE小柱去除雜質(zhì)，消除基質(zhì)抑制，使目標物獲得了良好回收率。本文建立的化妝品中新康唑等4種禁用物質(zhì)［7］的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，將有效填補抗生素檢驗方法的缺口，對保障消費者特別是兒童群體的權益和健康具有重大意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津液相色譜儀－SCIEX AB 5500+三重四極桿質(zhì)譜儀（日本島津與美國SCIEX公司）；BSA224SCW電子天平（德國賽多利斯公司）；MS3 basic渦旋振蕩器（德國IKA公司）；KQ－250DV型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli－Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；固相萃取系統(tǒng)（上海安譜科學儀器有限公司）；強陽離子交換小柱（200 mg，3 mL，上海安譜科學儀器有限公司）。

抑霉唑（純度99.2%，CAS：35554－44－0，美國Dr.Ehrenstorfer公司）；新康唑（純度98.0%，CAS：67914－69－6）、噻康唑（純度99.1%，CAS：65899－73－2）（美國CATO公司）；硫康唑（純度95.0%，CAS：61318－90－9，美國Aladdin公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（分析純，上海安譜科學儀器有限公司）；實驗用水（18.2 MΩ·cm）由Milli－Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 標準溶液的配制

分別精密稱取4種對照品10 mg，使用乙腈溶解，配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的標準儲備溶液，4℃保存。分別取適量標準儲備溶液用70%乙腈稀釋，配制成10 mg/L的標準中間液。取適量標準中間液，用70%乙腈稀釋成0.1、0.2、0.5、2、5、10、20、50、100 μg/L的系列標準混合溶液。

1.3 樣品前處理

稱取樣品0.2 g（精確至0.001 g）于10 mL具塞比色管中，加入2 mL 70%乙腈水溶液（甲酸調(diào)至pH 3.0），渦旋30 s使樣品分散，再定容至刻度，渦旋30 s后，超聲提取15 min。取樣液6 mL于10 mL塑料離心管中，6 500 r/min離心10 min。

取強陽離子交換固相萃取小柱，分別用5 mL甲醇和10 mL超純水活化，取離心上清液4 mL加入固相萃取柱，使其自然流下，用4 mL 2%甲酸水淋洗柱床后，再用4 mL含10%異丙醇的乙腈溶液淋洗柱床，洗耳球擠干后用4 mL含10%異丙醇的乙腈溶液（含2%氨水）洗脫目標物，收集流出液，過0.22 μm濾膜后待測。

1.4 儀器分析條件

色譜條件：Waters ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流動相：A相：0.1%甲酸水，B相：乙腈；流速：0.3 mL/min；進樣量：3 μL；柱溫：40℃；梯度洗脫程序：0～7 min，20%～50%B；7～9 min，50%B；9～9.1 min，50%～90%B；9.1～12 min，90%B。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI源）；監(jiān)測模式為正離子多反應監(jiān)測（MRM）；離子化電壓4 500 V；氣簾氣壓力137.8 kPa；噴霧氣壓力344.7 kPa；碰撞氣壓力62.1 kPa；離子源溫度450℃；監(jiān)測離子對、碰撞電壓（CE）和去簇電壓（DP）等參數(shù)見表1。

表1 4種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 4 antibiotics

2 結果與討論

2.1 方法建立

2.1.1 色譜柱的選擇4種抗生素的logP值在3.58～5.66之間，在C18色譜柱上均有較好的保留，因此考察了Waters ACQUITY HSS C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）、Agilent Poroshell 120 SB C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、Phenomenex Kintext C18（3 mm×100 mm，2.6 μm）幾種不同品牌規(guī)格的C18色譜柱對化合物的分析效果。結果顯示各化合物在不同的C18色譜柱上均能得到有效分離，且在Waters ACQUITY BEH C18柱上的峰形更加尖銳對稱，因此用該柱進行后續(xù)分析。

2.1.2 流動相的選擇比較了水－乙腈、水－甲醇兩種流動相體系對4種抗生素的色譜分離效果。結果顯示，水－乙腈體系的洗脫能力更強，峰形更加尖銳。比較了10 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸兩種不同流動相添加劑對色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)流動相中添加0.1%的甲酸時，能通過降低pH值使化合物離子化，有效提高化合物的響應強度。因此，確定0.1%甲酸水－乙腈作為流動相。

2.1.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化在MS Only模式下，將200 μg/L的混合標準溶液通過針泵注入質(zhì)譜。調(diào)整質(zhì)譜條件和掃描模式，獲取化合物的母離子和子離子信息。在負離子模式下，4種化合物均無信號，而在正離子模式下能獲得信號強度較高的母離子。這是因為咪唑環(huán)上的吡啶N堿性較強，極易結合H+帶正電，因此使用正離子模式進行分析。通過優(yōu)化碰撞能、去簇電壓和離子源溫度等參數(shù)，獲得強度較高且穩(wěn)定的化合物響應。

設置400、450、500、550℃4個離子源溫度，在正離子模式下對混合標準溶液進行分析，溫度升至450℃后，新康唑的信號強度有所降低，其他3種化合物響應強度幾乎無變化。因此，離子源溫度設置為450℃。

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇乙腈水溶液對化妝品具有較好的分散、提取效果，通常用于化妝品中各類激素等物質(zhì)的測定［2，8］。本文以乙腈水溶液為提取溶劑，并比較了不同乙腈含量（10%、20%、30%、40%、50%、70%、90%）對4種抗生素的提取效果。如圖1所示，隨著乙腈含量從10%升高到90%，新康唑、硫康唑和噻康唑的回收率逐漸升高后降低：乙腈含量大于30%后化合物的回收率超過70%，當乙腈含量達到90%后，部分目標物的回收率低于20%；抑霉唑在各含量提取溶劑中的回收率均低于70%，達不到分析要求。可能原因是目標化合物脂溶性較強，使用高含量有機溶劑提取時，存在大量的防腐劑、表面活性劑等共提物，影響了目標物的離子化效率，產(chǎn)生嚴重的基質(zhì)效應。為此，本研究進一步對基質(zhì)效應進行確認。選取一陰性膏霜樣品0.2 g，使用10 mL 70%乙腈水超聲提取15 min，離心后取上清液加入一定體積的混合標準溶液（各目標物最終質(zhì)量濃度為10 μg/L），將相同濃度的溶劑混合標準溶液和基質(zhì)標準溶液上機分析。以基質(zhì)標液中化合物響應值/溶劑標液中化合物響應值計算基質(zhì)效應。實驗結果顯示，新康唑、硫康唑、抑霉唑、噻康唑的基質(zhì)效應分別為0.52、0.51、0.95、0.64，即化合物受到不同程度的基質(zhì)抑制。因此需要進一步對70%乙腈水提取的樣品進行凈化處理以獲得符合分析要求的回收率。

圖1 4種抗生素在不同含量乙腈中的提取回收率Fig.1 Extraction recoveries of 4 antibiotics in different proportions of acetonitrile

2.2.2 固相萃取小柱的選擇HLB固相萃取小柱的基質(zhì)是含有親脂性二乙烯苯的大孔共聚物，在pH 1.0～14.0范圍內(nèi)非常穩(wěn)定，對非極性至中等極性的酸性、中性、堿性化合物均有較好的回收率，適用范圍廣。考慮到目標化合物的脂溶性和弱堿性，使用HLB小柱對樣品進行凈化，將凈化后的樣液上機分析。結果顯示，新康唑的回收率低于50%，可能是因為HLB小柱不能將目標物與雜質(zhì)分離，未能有效消除基質(zhì)效應。同時，由于HLB小柱對目標物的反相保留太強，導致部分目標物難以從柱上完全洗脫，影響回收率，因此HLB小柱不適合用于4種抗生素的凈化。

SCX小柱的官能團為苯磺酸，提取目標物時磺酸基團顯示陽離子交換性質(zhì)，而苯環(huán)顯示非極性吸附性質(zhì)。新康唑、硫康唑、抑霉唑、噻康唑為弱堿性化合物，pKa值分別為6.88、6.55、6.53和6.66，當溶液的pH值小于4.0時，化合物能夠完全離子化，與苯磺酸根結合，在柱上保留，用中性溶劑淋洗小柱即能去除中性和酸性共提物，達到凈化作用。因此使用SCX小柱凈化樣品。將凈化后的樣液上機測試，結果如圖2所示。經(jīng)SCX小柱凈化后，目標化合物的回收率較未凈化樣品顯著提高，新康唑的回收率更是從54.1%上升至96.3%。SCX小柱能有效凈化樣品，使化合物回收率滿足方法需求，因此選擇SCX小柱做進一步方法優(yōu)化。

圖2 4種抗生素使用不同固相萃取小柱凈化后的提取回收率Fig.2 Extraction recoveries of 4 antibiotics purified with different solid phase extraction cartridges

2.2.3 洗脫溶劑的選擇采用4 mL含2%氨水的乙腈溶液對淋洗后的柱床進行洗脫，收集洗脫液上機測試。結果顯示新康唑、抑霉唑和噻康唑的回收率良好，硫康唑的回收率為75%，相對較低。繼續(xù)對柱床洗脫，第5 mL的洗脫溶液中仍有硫康唑檢出。可能是由于SXC小柱有陽離子交換和非極性吸附雙重作用，使得logP值較高的硫康唑難以洗脫，因此應選擇極性更低的洗脫溶液。使用4 mL含10%異丙醇的乙腈（2%氨水）溶液洗脫目標物，收集洗脫液上機測試，發(fā)現(xiàn)硫康唑的回收率提高至80%以上，因此選擇該溶劑為洗脫溶劑。

2.3 線性關系、檢出限及定量下限

配制系列混合標準溶液進行測定，以目標物的峰面積（Y）對相應的質(zhì)量濃度（X，μg/L）進行線性回歸，得到各化合物的標準曲線方程。結果表明4種抗生素在其質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)（r）均為0.999。以3倍信噪比計算方法檢出限（LOD），以10倍信噪比計算方法定量下限（LOQ），得到4種抗生素的LOD和LOQ分別為0.005～0.250 μg/g和0.010～0.500 μg/g（表2）。結果表明，4種抗生素的線性關系良好，方法的檢出限和定量下限均可滿足化妝品的檢測需要。

表2 4種抗生素的線性關系、檢出限和定量下限Table 2 Linear relationships，LODs and LOQs of 4 antibiotics

2.4 回收率及相對標準偏差

選取3種典型化妝品（水、乳液、膏霜）作為加標基質(zhì)，分別按照1倍、2倍和10倍定量下限進行低、中、高3個濃度水平的加標回收實驗，按照本方法進行前處理和測定，每個濃度水平平行測定6次，計算得到4種抗生素的平均回收率為89.3%～113%，相對標準偏差（RSD）為0.90%～7.2%（表3），滿足準確度和精密度要求。

表3 4種抗生素的回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 4 antibiotics（n=6）

2.5 實際樣品測定

對市面上銷售的100多個批次的水、乳、膏霜使用上述方法進行測定，結果在4個批次產(chǎn)品中檢測出新康唑，含量范圍為0.24～1.25×104mg/kg，主要為兒童護臀霜產(chǎn)品。圖3為陽性樣品譜圖。

圖3 新康唑陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.3 Extraction ion chromatogram of an elubiol positive sample

3 結論

通過優(yōu)化前處理條件和儀器方法建立了測定兒童化妝品中新康唑等4種抗生素的固相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，基于該類化合物咪唑環(huán)上吡啶N有較強堿性的特點，用強陽離子交換SPE小柱去除共提物，獲得了較好回收率。該方法高效、準確、特異性好，能夠為化妝品相關質(zhì)量監(jiān)管提供有效的技術支持。目前，雖然新康唑在兒童化妝品中存在非法添加事實，但缺少相關檢出情況的報告及檢驗方法，還處于監(jiān)管盲區(qū)。在此呼吁相關監(jiān)管部門擴大兒童化妝品中抗生素的監(jiān)測范圍，防止不法分子利用監(jiān)管漏洞非法牟利，危害兒童健康。