基于微流控的植物根部-微生物相互作用研究進展

陳登博付玉明馮佳界

(1.北京航空航天大學生物與醫學工程學院,北京 100191;2.北京航空航天大學空天生物技術與醫學工程國際聯合研究中心,北京 100191)

1 引言

植物栽培是地面和受控生態生命保障系統的重要組成部分。植物的根系有固定植株、吸收水分和養分等重要功能,根際微生物在植物根表或近根部位生長繁殖,是植物微生物組的重要組成部分。植物脫落物或分泌物可到達根際微區,在根系周圍形成豐富而復雜的化學環境[1],是植物在長期進化過程中形成的一種適應外界環境變化的重要機制[2]。這些植物脫落物或分泌物為微生物提供營養,以此構建和調節根際微生物菌群[3];另一方面,根際微生物也會深度參與調解植物生理活動[4-5]。因此,植物與微生物的根際相互作用(簡稱根-菌互作)是植物學和微生物學研究的熱點問題。傳統的根-菌互作研究所用的栽培方式難以實時營造對根際研究所需化學環境,且由于需要將植物根部取出進行采樣和成像觀察,使得采樣和成像不具有實時性(時間分辨率較低),難以復現動態的互作過程。并且根毛可增加根表面積,為根部探索更大空間,在根生理學研究中具有重要地位,但卻因為尺度過小而難以采樣和成像等。因此,根-菌相互作用的實時化、可視化和操控性研究是一項新的挑戰。

近年來,控制小體積流體的微流控芯片技術(或稱為芯片實驗室)為生物學研究的實時化和可視化提供了新方法,在根-菌互作研究中展現出巨大潛力。微流控技術在根-菌互作研究中具有三大優勢: ①透明的芯片可實現根-菌互作的實時成像; ②可實現對根際環境的多次采樣; ③可對根際化學環境實現準確操控,以研究化學環境對互作的影響。目前最廣泛采用的芯片構建流程及材料為:按照所需的芯片設計圖紙,以光刻機制作與其互補的光刻膠材質或3D 打印制作塑料材質的模板(Template/mold),以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)澆注到模板上成型后剝離,再以等離子體氧化PDMS 的需封裝面(即有芯片通道的面)以活化其表面基團,最后放置玻璃片至封裝面上鍵合以完成封裝[6]。相對于二氧化硅、熱固性塑料、熱塑性塑料等其他可選的芯片材質,PDMS 的價格低廉、偏軟質、制作模板后可快速批量澆注制取等優勢,使其成為主流芯片制作流程中常用材料[6]。等離子體氧化封裝方式是不可逆的,即封裝后很難將PDMS 從玻璃片上拆卸;若實驗有拆卸需求,可考慮可逆的封裝方式,直接在室溫下依賴PDMS 和玻璃片間的范德華力封裝,但這樣封裝不嚴密,在外力和內壓下容易因意外拆卸開[7]。

高等植物可以再生氧氣、食物和水,是生物再生生命保障系統(Bioregenerative Life Support System,BLSS)的功能核心[8]。而空間特殊環境(微重力、輻射、磁場、密閉、微生物多樣性受限等)對根-菌互作的影響尚不明晰,前期搭載實驗表明植物對微生物病害的敏感性可能增加[9]。而微流控技術體積小、性價比高,對于空間研究也獨具優勢。本文綜述了基于微流控的植物根部發育和根-菌互作的研究,闡述微流控芯片針對不同栽培基質的成像及對根際化學環境的操控/采樣功能的優勢,分析了芯片針對不同根系形態需求的研究,并對微流控技術在空間環境根-菌互作研究中的重要作用進行展望。

2 根-菌互作芯片的成像技術

主流微流控芯片的材質(PDMS、玻璃片等)透光性好,對根-菌互作的成像觀察獨具優勢。若能結合熒光等生物發光技術和一些高級成像技術,將可以更全面地還原根-菌互作過程。

Massalha 等[10-11]構建的微流控系統TRIS(Tracking Root Interactions System)是一個研究根-菌互作的典型裝置,如圖1(a)所示,體現了生物熒光技術在芯片根-菌互作成像中的出色效果。TRIS 系統采用PDMS-玻璃片材質,在灌有固體植物培養基的移液器吸頭中令擬南芥發苗,在根長出吸頭前移栽至芯片通道入口令其向芯片中生長,并使用注射泵將液體培養基和所感興趣的根際菌(枯草芽孢桿菌作為植物有益菌,大腸桿菌作為有害菌)注射進芯片通道內,這些方法在根-菌互作的芯片研究中被普遍使用。為了實時顯微觀察,該裝置直接安裝在顯微鏡上。在無菌芯片中接種了表達紅色熒光蛋白的枯草芽孢桿菌和表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌,使用激光掃描共焦顯微鏡分別熒光成像并疊加圖像,發現在接種后12 h 當中,枯草芽孢桿菌向根伸長區聚集并定殖,大腸桿菌卻被排除在根表面之外,通過圖像觀察菌群行為動態,可推測出有益菌對植物針對病原體的保護機制。除使用熒光標記的細菌之外,該研究還使用了僅在6 個特定根區(皮層、脈管系統、根毛等)表達綠色熒光蛋白的6 種熒光擬南芥株系,并與紅色熒光蛋白的枯草芽孢桿菌圖像疊加,觀察到了桿菌接種后6 h 內向根伸長區的明顯趨化行為,實現熒光標記的植物和細菌共同成像。

圖1 針對根-菌互作的芯片Fig.1 Chip for root bacteria interaction

在可見光(包括熒光)手段之外,電子顯微鏡和原子力顯微鏡等先進成像技術的分辨率更高,可在根-菌互作研究中作為更高級的、細胞器水平的成像手段。比如根毛就是一種微米級的根部結構,可以應用這兩種高級成像手段。與光學顯微鏡不同,這兩者都要求觀察面暴露在外,而根卻被封裝在芯片中。由于等離子體氧化法的封裝是不可逆的,很難打開封裝以將根和根際區暴露在外。針對這一需求,Aufrecht 等[12]設計了一種可拆卸的、針對根毛研究的芯片,PDMS 并未化學鍵合到玻璃片上,而只是在高壓滅菌時形成了較弱的物理鍵,且用瓊脂固化圍住PDMS 以進一步固定及保濕,如圖1(b)所示。其可在光學成像完成后拆卸開以供電鏡等成像。針對根毛研究的目的,芯片被設計成了兩層(Two-layer)式的階梯狀腔室,較高的腔室(200 μm)容納主根、兩側較低的腔室(20 μm)容納根毛,實測證明根毛生長時可自然粘附在PDMS 面上,在拆卸過程中可保持在原位,利于后續的電子顯微鏡/原子力顯微鏡對根毛的成像研究。研究人員進一步使用該芯片跟蹤了2種植物益生菌在擬南芥發育早期根部定殖情況[13],結果發現,無論細菌種類和接種濃度如何,4 天后細菌細胞在根表面的覆蓋面積均為1%～2%,且根的發育情況很大程度上取決于細菌接種的種類和濃度。

3 芯片技術對不透明栽培基質的成像優勢

芯片通道中裝載液體基質時,其在光學上透明的性質有助于成像,但液體并不是自然界或人工栽培的主流基質,自然環境中的根-菌互作大多發生在土壤等固體基質中。若將土壤引入芯片,以解決土壤顆粒不透明導致的可見光成像困難等問題,生物熒光和某些顯微光譜成像技術或可成為其研究手段。

Mafla-Endara 等[14]設計了土壤芯片,將土壤置于芯片通道入口處,以可見光觀察土壤及微生物擴散進入通道的過程,以揭示土壤生態系統的形成過程。研究發現,土壤液體和真菌菌絲是土壤物質擴散的主要驅動力,土壤顆粒和微生物在充滿液體的通道中擴散比在空氣中快得多,且真菌菌絲可攜帶細菌穿過氣體障礙而擴散定殖。芯片成像還可用于量化土壤顆粒的運動模式,對所得顯微視頻中2～6 μm 土壤顆粒使用自動追蹤算法制作速度-位置熱圖,發現土壤顆粒被芯片內部的流水拖拽形成蜿蜒的運動模式,也使細菌很快地移動。雖未引入植物,該研究使用的土壤芯片已展現了對根-菌互作的可見光成像研究潛力。

也有研究嘗試讓植物根進入裝載有固體基質的芯片,以研究基質中的根-菌互作。Gao 等[15]描述了EcoFAB(Ecosystem Fabrication)芯片制作方法,可向通道內裝載沙子或土壤作為基質,以期在更接近自然條件的微環境中研究根-菌互作,如圖2 所示。觀察發現,雖然在亮場(可見光)下,沙子和土壤的不透明性質讓埋在其中的根系和微生物不可見,但在熒光顯微鏡下,熒光標記的根際益生菌Pseudomonassimea在土中清晰可見,展現了熒光技術克服土壤不透明性成像的潛力。這種益生菌在沙子中集中于植物根尖,而在土壤中集中于芯片開口處。研究表明沙子的貧營養迫使益生菌定殖于根尖以攝取分泌物,而土壤的富營養使芯片開口處的氧氣成為益生菌的首要需求。

圖2 EcoFAbs 的應用[15]Fig.2 The applications of EcoFABs[15]

值得注意的是,EcoFAB 的實驗流程認為可使用鑷子將裸露的植物幼苗直接從發苗的固體培養基上移栽至芯片的孔道內[15];而幾乎所有其他芯片-植物的結合研究都選擇使用內有固體培養基的移液器吸頭作為發苗載體,并模塊化地整體移栽至芯片孔道內[10,13,16],以防止移栽過程對根的傷害。使用移液器的成活率明顯高于使用鑷子的移栽,雖然使用鑷子的做法更接近自然條件,但對實驗操作要求較高,很難不傷害根系。至于直接在灌注培養基的芯片中發苗的方法[17],由于植物的發芽率并非100%等原因,失敗率相對更高。

針對土壤顆粒對可見光的不透明性,Pucetaite 等[18]推薦對土壤芯片使用可見光光譜之外的、先進的顯微光譜成像技術,以克服土壤的不透明性,利于在微觀尺度監測土壤微生物和相關的生物地球化學過程。這些非可見光的顯微光譜成像技術包括紅外吸收、拉曼散射和基于同步輻射的X 射線顯微光譜技術等,有時需要在土壤中加入穩定同位素或納米貴金屬粒子等輔助成像定位,在微生物鑒定、代謝物/污染物的定量/定位等方面各有優勢,也可運用于基于固體基質芯片的根-菌互作研究中。

4 芯片技術對根際化學環境的操控/采樣功能優勢

利用微流控亦可在時空上快速操控/監測根周圍的化學環境,研究根部對生物或非生物因素的動態響應,例如一系列以RootChip 命名的芯片設計[19],如圖3 所示。最初Grossmann 等[19]開發的RootChip 被用于根對化學環境的響應研究,并以根內的葡萄糖熒光傳感器開展熒光成像,成功發現細胞內糖水平的改變主要發生在灌注了葡萄糖的根尖。對于使用擬南芥的研究,RootChip 可在幾厘米內(＜10 cm)部署多個平行通道,以一次性開展多個植株的重復性實驗。Fendrych 等[20]采用豎直放置的vRootChip(v 意為vertical,豎直以不影響根向地性)研究根部生長的基因通路,觀察擬南芥根生長情況數天,發現無生長素存在時擬南芥的根生長速度會在30 s 內迅速下降;補充少量生長素后,根生長速度又會在2 min 內恢復;并通過向芯片中根際環境注入cvxIAA、ccvTIR1 等人工配體,最終確認了以TIR1/AFBAux/IAA 共受體復合物為基礎的一個調節根生長的非轉錄分支[20]。Guichard 等[21]開發了根生長通道更長的RootChip-8S 微流控裝置,Denninger等[22]用其跟蹤觀察了與根毛形成相關的細胞極化過程機理,發現基因GEF3 在細胞極化過程中有作為細胞膜標志物的作用。

圖3 安裝8 個植物的RootChip[19]Fig. 3 Image of a RootChip with eight mounted live plants[19]

一些芯片設計甚至可令同一植株的根部的不同部位分別處于不同化學環境中,以在完全排除個體差異因素的前提下,直觀對比不同化學環境對根雙側的影響或對特定根段的影響。面向根生理學或環境異質性研究,研究人員通常使用雙流或多流匯總的方式,即多種液體從多個入口匯總到同一條芯片通道中,來營造分界式共存的液體化學環境。

對于分根段施加不同的化學環境,Meier等[23]在2010年開發了可對擬南芥施加多層流化學刺激的芯片,實際使用生長素類似物2,4-D 和生長素抑制劑NPA,層流的方向與根垂直,以驗證生長素和抑制劑對指定根段的影響。研究設置了3 個進液口以達成3 層的層流,以控制流量的手段成功制造了厚度10 μm(約1 個根細胞長度)的2,4-D 層,這一厚度是被摻雜在2,4-D 中的熒光微球所顯示。因為使用了生長素調節劑偶聯熒光蛋白的擬南芥株系,采用熒光顯微鏡觀察到了2,4-D 在短短幾分鐘后令10 μm 長的根段長出了根毛,表明了生長素影響可在單個根細胞尺度上發生,也證明了微流控研究在很小尺度(～10 μm)上的化學刺激對根影響的能力。值得一提的是,由于層流的方向與根垂直,驗證了大/小的流量中根的生長沒有顯著區別,從而排除了剪切力(～10 dyne/cm2)可能造成的額外影響。

對于雙側施加不同的化學環境,Stanley 等[16]設計了雙流RootChip(Dual-flow-RootChip),令2種液體平行于根軸同時進入通道,形成不對稱的化學環境,也描述了詳細的芯片實驗步驟[24]。研究分別采用NaCl、磷酸鹽和聚乙二醇在雙流RootChip 中模擬干旱等脅迫形式,在根雙側不對稱處理,研究根毛生長情況,證明根在生理和轉錄水平上具有局部適應環境中異質條件的能力,也證明雙流芯片方法有助于還原根與環境相互作用的決策過程[16]。研究表明,每個根毛細胞可以自主地對環境做出響應[16,23]。

微流控芯片的采樣功能有較大潛力。芯片的流出液是其內部環境的重要樣品,通過收集芯片的流出液,即可完成植物根際微生物和根系分泌物的采集,從而進行根際微生物組與代謝組分析。但實際開展了采樣并使用組學手段分析的研究并不多。其原因是關注復雜微生物群落研究較少,而對有限個菌株的行為,使用熒光標記等技術即可揭示,如Massalha 等[10]和Aufrecht 等[13]的研究;另外對于根際研究,很多根際菌定殖在根部表面甚至內部,難以隨流出液流出。

5 芯片技術對根系形態等特殊需求的優勢

植物根系具有多種形狀和尺寸,可為之相應設計適合的微流控通道和腔體,以讓植株正常生長或方便成像。為研究根系較粗的植物,Khan等[25]使用3D 打印的模具制備了腔體高度10 mm的PDMS 材質芯片,如圖4(a)所示,用于研究二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon,根系直徑1～3 mm)的根細胞和分析滲透脅迫下的基因表達,發現了基因BdDi19 在幼苗短期滲透脅迫期間有表達。此外,針對須根系統研究,相對于傳統的單條直道的芯片設計,Chai 等[26]采用多室設計的微流控芯片,如圖4(b)所示,令水稻的分枝根生長到一組徑向的花瓣形室中,用以研究滲透脅迫(模擬干旱環境)對根系發育的影響,發現隨著聚乙二醇(PEG6000,用于營造滲透脅迫)濃度的增加,根的生長變慢,根毛的數量和長度增加,根尖邊緣細胞的發育和聚集增多。

圖4 應用于不同植物的芯片Fig.4 Chips for different plants

為了方便顯微觀察,微流控芯片的尺寸普遍設計得較小,并且使用擬南芥等小型草本物種,這讓根-菌互作的長期化觀察以及對個體較大的木本植物的研究成為挑戰。Noirot-Gros 等[27]設計的根系-微生物相互作用芯片(RMI-chip),如圖4(c)所示,通道長達36 mm,可以培養山楊(木本植物)幼苗的根超過1 個月,并且可以連續使用顯微鏡觀察根-菌互作。研究發現細菌需要在山楊根部表面形成生物膜才能持久定殖。RMI 芯片加以修改或優化,可以用于長期觀察生長緩慢的植物,或者短期研究生長較快的植物。

此外,設計功能導向性很強的特殊結構芯片,如Massalha 等[10]的TRIS 系統還有一個雙根通道版本,在同一腔室里生長2 株擬南芥的根,并設計了分隔結構避免雙根的物理接觸,卻允許微生物細胞和信號分子的自由流動,以直觀地顯示細菌對不同基因型株系根部的定殖偏好。根據具體需求而設計開發出來的微流控芯片更能滿足各種植物生長的特殊需求,也是微流控芯片的優勢之一。

6 根-菌互作空間研究現狀及展望

高等植物是BLSS 的功能核心,但空間環境因素導致植物生長處于逆境,對植物的生長發育具有顯著影響。在太空飛行等空間環境下發現在微重力下生長的植物表現出對植物病菌的敏感性增加[28],地面3D 回轉模擬微重力效應下的實驗也證明了在模擬微重力效應下病菌更易侵染植物[29-31]。一方面可能是因為微重力對細胞壁的重生和木質素的合成起到了抑制作用[32],從而利于病原真菌的侵染;另一方面推測是微重力影響了植物宿主與自身微生物的相互作用。雖然植物遺傳適應相對較慢,但植物共生的微生物卻能夠很快地適應環境變化[33]。而植物根際微生物組是植物的第2 套基因組的組成部分,在植物生長發育過程當中起著至關重要的作用。植物益生菌對植物具有保護機制,可以形成生物膜以及生產植物激素從而提高植物個體抵御非外來的微生物環境脅迫的免疫能力、誘導免疫抗性等多種手段,從而來增強其對宿主的免疫抗逆、抗病能力[34],且微生物是BLSS 中必然存在的一個鏈環,因此有必要研究空間環境下植物的根-菌互作。

但是受控條件下植物根際微生物的結構變化以及潛在威脅微生物研究甚少。由于空間實驗的空間有限,即使對于探空火箭等所擁有的超過10 cm × 10 cm × 10 cm 體積的實驗空間[35-36],對于使用傳統栽培方式的根-菌互作研究也明顯不夠。而且,由于空間搭載機會的稀缺和昂貴,很多實驗必須先期在地面開展,在回轉儀等模擬的微重力環境下進行[37-38]。與真正的空間實驗相似,回轉儀可供實驗的區域非常狹小,同樣難以容納傳統栽培方式的植株。

微流控技術可以成為空間生物學研究中很有前途的工具,已經運用在國際空間站或衛星搭載的太空實驗上。如應用于國際空間站的一種新的不依賴培養物的微生物監測系統(the Lab-On-a-Chip Application Development Portable Test System,LOCAD-PTS)[39],在15 min 內定量分析了艙室表面的內毒素(革蘭氏陰性細菌和真菌的標志)。在目前第一個長時間的活體生物立方體衛星實驗中,Nicholson 等[40]開展生命有機體軌道空間環境生存性(Space Environment Survivability of Living Organisms,SESLO)實驗6 個月,測定了枯草芽孢桿菌孢子在空間環境中長期靜止(14、91和181 天)后的萌發、生長和代謝情況。但目前空間生物學研究中,未將微流控技術應用在植物根-菌互作研究上。而微流控芯片體積小,且目前已有一些微流控根-菌互作研究沒有采用注射泵,同樣可實現根際營養液的更新[15]。微流控芯片作為載體更能滿足研究需求。因此,如圖5 所示,對于長期進化適應1 G 重力的地球環境的植物而言,空間微重力環境屬于典型的逆境環境,可能導致植物菌群失調,但目前對其機理并不清楚。基于微流控技術能更直觀地研究植物-微生物在空間極端環境下相互作用機理,并可以通過其機理精準調控植物根部菌群,使植物擁有更大的固碳能力和更強的抗逆特性。

圖5 空間環境下微流控技術在根-菌互作研究中的運用Fig.5 Application of microfluidic technique in the study of root-bacteria interaction in spatial environment

微流控技術在根-菌互作研究中的顯著優勢能進一步幫助研究者理解植物學和微生物學研究的熱點問題。但在空間環境下基于微流控技術開展植物根-菌互作研究依然存在著許多問題:①空間環境下,植物根生長會改變方向,對基于微流控技術的根菌互作觀察有一定影響;②在芯片設計的過程中還需要考慮表面張力會成為界面的主要力;③目前的微流控技術主要針對在透明基底上成像,這將偏離自然土壤系統中根際的群落結構。這些問題需要利用更有效的方法來解決。

7 結語

目前,已有研究將微流控技術運用于根-菌互作中,顯著提高了實驗效率與根菌研究結果的分辨率。然而迄今為止,國際上在空間環境下應用微流控技術研究植物-微生物相互作用仍是空白。微流控技術具有便于對根菌互作實時成像以及對根際化學環境的操控/采樣等優勢,能夠精細刻畫反映出空間環境下植物-微生物互作規律,有益于揭示植物-微生物穩態對空間環境效應的響應與適應機制,從而助力空間環境下植物健康穩定生產,為BLSS 空間實際構建應用奠定基礎。