鼻息肉組織相關受體表達與Eos浸潤相關性

趙 冉 許建華

鼻腔組織高度水腫是鼻息肉的主要表現，發病率為1%～4%[1]。鼻黏膜嗜酸性粒細胞(eosinophils，Eos)浸潤增多是鼻息肉發病的主要病理基礎之一，可致鼻息肉組織微環境失調，加重鼻息肉病情[2]。白介素-5(interleukin-5，IL-5)可通過刺激Eos前體細胞的增殖、分化來調節Eos浸潤程度，是Eos的重要趨化因子[3]。芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)可與配體相結合參與多種免疫反應過程并調節機體功能，與哮喘、特異性皮炎和類風濕性關節炎等自身免疫疾病的發病密切相關[4]。維甲酸相關孤兒受體(retinoic acid-related orphan γt，RORγt)是小鼠及人類輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)主要轉錄因子，通過促進Th17細胞分化和特異性表達分泌參與癌癥、感染性疾病和免疫疾病的發病過程[5]。既往研究[6]指出，IL-5可刺激Eos生物學活性繼而影響鼻息肉發病。但AhR、RORγt等細胞因子是否同樣與Eos浸潤以及鼻息肉發病機制有關目前尚不明確。本研究對鼻息肉患者息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達水平進行檢測，分析其與Eos浸潤程度之間的關系，以深入了解鼻息肉的發病機制，為臨床治療鼻息肉提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年3～12月重慶醫科大學附屬渝北醫院耳鼻喉科收治的37例鼻內鏡下行鼻竇手術切除的鼻息肉患者作為息肉組，同期20例行單純鼻中隔偏曲矯正術的中鼻甲黏膜患者作為正常組。兩組患者性別、年齡、病程等一般資料相比，差異無統計學意義(P>0.05)。按照浸潤程度不同將患者分為I度浸潤組(n=11)、Ⅱ組浸潤組(n=17)和Ⅲ度浸潤組(n=9)，Ⅰ度浸潤組男性7例，女性9例，年齡(32.10±2.85)歲；Ⅱ度浸潤組男性9例，女性8例，年齡(32.18±3.11)歲；Ⅲ度浸潤組男性5例，女性4例，年齡(32.15±2.79)歲，3組患者性別、年齡等一般資料相比，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經重慶醫科大學附屬渝北醫院倫理委員會批準(倫理批號：ZCYLC20200815)。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①息肉組患者均符合《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南》[7]中指出的鼻息肉相關診斷標準；②所有患者均經術前鼻內窺鏡檢查、CT檢查及術后病理檢查證實為鼻竇炎鼻息肉或鼻中隔偏曲者；③臨床資料完整，均留取鼻息肉或鼻黏膜組織待測者。排除標準：①近1個月內接受過糖皮質激素、類固醇激素及抗組胺藥物治療者；②近1周內并發急性呼吸道感染者；③合并變異性鼻炎、真菌性鼻竇炎；④合并哮喘患者。

1.3 樣本收集及保存 息肉組患者均于鼻內窺鏡視野下鉗取3 mm×3 mm的息肉頭端組織，正常組研究對象取距鼻甲頭端上緣4～5 mm處的正常黏膜組織，生理鹽水洗去雜質后用潔凈的紗布蘸干水分，以4%多聚甲醛固定24～48 h，取其中一部分以石蠟包埋后制成組織切片，另一部分于4℃條件下保存于70%乙醇溶液中。

1.4 檢測方法

1.4.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative Real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)[8]取經上述方法處理后的兩組研究對象冷凍鼻息肉組織及鼻黏膜組織，以Trizol試劑提取組織中的總RNA，采用反轉錄試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰荆浱枺篕L-170403-10)將樣本中的總RNA逆轉錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR儀(美國Invitrogen公司，型號：ABI 7500)進行qRT-PCR，以β-actin(上海艾博抗公司，貨號：ab8226)為標準化內參檢測鼻息肉及鼻黏膜組織中IL-5和AhR的表達水平。見表1。

表1 IL-5和AhR引物設計

1.4.2 蘇木素-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)和免疫組織化學法 取經上述方法處理后的兩組研究對象鼻息肉及鼻黏膜組織石蠟切片，均行HE染色和RORγt免疫組化[9]。石蠟標本脫蠟水化后以pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，以枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復抗原，室溫下與3%過氧化氫溶液共同孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，與50 μL的RORγt一抗室溫下共同培養1 h，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加50 μL的聚合物增強劑，室溫下共同培養20 min后磷酸鹽緩沖液再次沖洗3次，與50 μL酶標鼠抗兔聚合物室溫下共同培養30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次。加入DAB顯色液共同培養5 min，電鏡下觀察到棕黃色或黃色即為陽性顯色。蘇木精染色液復染后以0.1%氯化氫溶液分化，流水沖洗后氨水返藍，梯度乙醇脫水后透明封片，晾干后電鏡下觀察。

1.5 觀察指標 ①病情程度：參考《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南》[7]和文獻[10]對所有研究對象進行視覺模擬量表(visual analog scale，VAS)評分、CT評分和內鏡評分；②實驗室指標：觀察并比較兩組研究對象鼻息肉組織和鼻黏膜組織中IL-5、AhR、RORγt和Eos計數，依據400倍鏡視野下100個炎性細胞中Eos計數水平計算Eos浸潤程度，將浸潤指數為0%～33%視為I度浸潤，浸潤指數為34%～66%視為Ⅱ度浸潤，浸潤指數為67%～100%視為Ⅲ度浸潤[11]。比較不同浸潤程度患者鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達水平，并分析鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達水平與Eos浸潤程度之間的相關性。

2 結果

2.1 兩組研究對象VAS評分、CT評分和內鏡評分比較 息肉組患者VAS評分、CT評分和內鏡評分均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象VAS評分、CT評分和內鏡評分比較分)

2.2 兩組研究對象IL-5、AhR和RORγt表達水平比較 息肉組患者鼻息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達水平均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 兩組研究對象IL-5、AhR和RORγt表達水平比較

圖1 兩組研究對象IL-5和AhR的mRNA表達水平比較

2.3 兩組研究對象嗜酸性粒細胞浸潤程度比較 息肉組患者Eos計數和Eos密度均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 兩組研究對象嗜酸性粒細胞浸潤程度比較

2.4 不同浸潤程度患者鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達水平比較 3組不同浸潤程度患者息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達水平差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

注：A為息肉組；B為正常組；箭頭所示為嗜酸性粒細胞。

表5 不同浸潤程度患者鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達水平比較

2.5 鼻息肉組織IL-5、AhR和RORγt表達水平與嗜酸性粒細胞浸潤程度的相關性 鼻息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達水平與Eos計數及Eos密度均呈正相關關系(P<0.05)。見圖3。

注：IL-5為白介素-5，AhR為芳香烴受體，RORγt為轉錄因子維甲酸相關孤兒受體，EOS為嗜酸性粒細胞。

3 討論

鼻息肉是指鼻腔及鼻竇黏膜并發慢性炎癥性疾病，患者臨床表現為單側或雙側持續性鼻塞、流涕且伴有漸進性加重，部分患者還因息肉阻塞鼻道、咽鼓管等部位引發嗅覺減退、耳鳴和聽力下降[12]。現階段臨床治療鼻息肉多采用糖皮質激素輔助鼻內鏡切除手術方式，但存在易復發問題[13]。本研究從鼻息肉發病機制出發，探討息肉組織與正常黏膜組織中IL-5、AhR、RORγt表達和Eos浸潤差異，分析IL-5、AhR和RORγt與Eos浸潤之間的關系，旨在為臨床治療鼻息肉提供更多思路。

本研究結果顯示，息肉患者各項評分、組織標本在IL-5、AhR、RORγt表達和Eos浸潤程度均高于正常組，且3組不同浸潤程度患者息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達水平差異有統計學意義(P<0.05)，表明IL-5、AhR和RORγt在鼻息肉患者Eos浸潤及發病過程中發揮重要作用。IL-5是誘導Eos浸潤的主要炎性細胞因子[14]，AhR可與小分子配體結合促進Th17細胞產生白介素-17等炎性介質[15]，RORγt可與信號轉導和轉錄激活因子5結合加速Th17釋放炎性細胞因子[16]。Eos浸潤是導致鼻息肉加重的重要病理基礎，趨化的Eos大量聚集于臨近息肉組織，引起IL-5、白介素-17等炎性細胞因子大量釋放，加速中性粒細胞聚集，并持續作用于上皮細胞、成纖維細胞、基底膜及呼吸道黏膜，使得息肉附近血管通透性增加，EOS浸潤和息肉病情進行性加重[17]。因此，鼻息肉組織中Eos浸潤程度不同，IL-5、AhR和RORγt表達水平也不同。

本研究發現，鼻息肉組織中IL-5、AhR和RORγt表達水平與Eos計數及Eos密度均呈正相關關系，這與李帥祥等[18]研究結論相似。IL-5作為誘導Eos浸潤發生的最關鍵因子，對于鼻息肉組織中Eos浸潤增加具有重要調節作用，可與Th17細胞協同作用加重Eos浸潤[19]。AhR可與其受體結合參與Th17炎性反應的發生，與低濃度的轉化生長因子-β和IL-5、白介素-6相互作用，上調細胞及組織中RORγt的表達，誘導TH17細胞分化，使Th17反應增強，誘導基質細胞分泌大量的白介素-6、前列腺素E2、一氧化氮等炎性介質，增厚鼻息肉組織基底膜，加速基質纖維化進程和組織結構重塑，引起鼻腔黏膜慢性炎癥性損傷[20]，進一步增加Eos浸潤，引起鼻息肉組織中Eos計數和密度增加[21]。

綜上所述，鼻息肉組織中IL-5、AhR和RORγt水平與Eos浸潤程度有關，監測上述細胞因子的表達可作為預測和判斷Eos浸潤和鼻息肉發病的有效指標，對于鼻息肉的臨床診治有較高的指導價值。