紅三葉草提取物中四種異黃酮的HPLC檢測(cè)方法

李彥軍，鄭 楠，王加啟，趙圣國(guó)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

大豆苷元、染料木素、鷹嘴豆素A和刺芒柄花素是異黃酮類植物雌激素，具有抗氧化、抗炎和抗菌等生物學(xué)功能（Ludmila等，2019）。研究表明，日糧中添加大豆異黃酮可以改善動(dòng)物的內(nèi)激素水平（肖凡等，2020），提高斷奶仔豬（林廈菁等，2020）、荷斯坦奶牛犢牛（肖凡等，2020）和羊的生長(zhǎng)性能（毛玉平等，2019），以及機(jī)體的抗氧化能力（林廈菁等，2020）。大豆苷元和染料木素可以緩解奶牛泌乳后期產(chǎn)奶量的下降趨勢(shì)，在一定程度上提高產(chǎn)奶量，乳蛋白質(zhì)含量也明顯增加（沈菲等，2020；Zhu等，2006），這可能是由于大豆苷元和染料木素促進(jìn)了牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖（劉春龍等，2010）。大豆苷元和染料木素還可以提高鳥(niǎo)類的產(chǎn)蛋性能和蛋殼質(zhì)量，提高飼料轉(zhuǎn)化效率（Cai等，2013；Akdemir等，2009）。另外，鷹嘴豆素A能改變瘤胃微生物的菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)纖維素降解，提高日糧中蛋白質(zhì)的利用率和肉牛的平均日增重，以及緩解瘤胃酸中毒（Harlow等，2021，2017a，2017b；Flythe等，2013）。紅三葉草（Lemeziene等，2015）是大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的主要來(lái)源。紅三葉草是多年生的豆科植物，營(yíng)養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高，是我國(guó)主要的牧草之一（鞏建峰，1996）。因此紅三葉草也是反芻動(dòng)物攝入刺芒柄花素和鷹嘴豆素A等異黃酮的主要來(lái)源。王凱等（2017）表示紅三葉草和苜蓿提取物可以提高羔羊的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，這主要取決于鷹嘴豆素A與刺芒柄花素等其他異黃酮的交互作用（Harlow等，2020），這表明紅三葉草提取物是一種潛在的可以提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化率的天然飼料添加劑。

為了開(kāi)發(fā)紅三葉草提取物的相關(guān)產(chǎn)品，需要開(kāi)發(fā)一種能夠快速、全面、準(zhǔn)確地測(cè)定產(chǎn)品中大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A含量的HPLC方法。目前，異黃酮的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法（陳寒青等，2005）、氣相色譜-質(zhì)譜法（Iannone等，2019；Hossain等，2019）和高效液相色譜法/高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）（Zhou等，2020；李天雪等，2018；張念等，2011；Krenn等，2006；Delmonte等，2006）。HPLC法具有特異性強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。雖然檢測(cè)異黃酮的HPLC方法較多，但是能夠同時(shí)檢測(cè)紅三葉草提取物中鷹嘴豆素A、刺芒柄花素、染料木素和大豆苷元的方法較少。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種可以同時(shí)測(cè)定紅三葉草提取物中大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A含量的HPLC檢測(cè)方法，以期為紅三葉草提取物產(chǎn)品中四種異黃酮的檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Waters 2695高效液相色譜儀（Waters）；2998二極管陣列檢測(cè)器（Waters）；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾利超聲儀器有限公司）。

鷹嘴豆素A、染料木素、刺芒柄花素和大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品全部購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度均≥98%；甲醇為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；無(wú)水磷酸氫二鈉和鹽酸均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為雙蒸水；6號(hào)溶劑購(gòu)自武漢奧萊特生物科技有限公司；紅三葉草來(lái)自甘肅省岷縣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為χBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters）；流動(dòng)相為甲醇（A）和10 mmol磷酸氫二鈉溶液（B）；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；洗脫梯度見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度%

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液的配制 分別準(zhǔn)確稱取鷹嘴豆素A、染料木素、刺芒柄花素和大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品20 mg（精確至0.01 mg）于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，配制成濃度為200 μg/mL的儲(chǔ)備液，于-20℃以下保存。

1.2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 分別準(zhǔn)確量取10 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于50 mL離心管，混勻，然后準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋，配成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度分別為50、25、15、10、5、1 μg/mL。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別量取1 mL上述系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液通過(guò)0.45 μm濾膜。按照從低濃度到高濃度的順序依次進(jìn)樣，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣兩次，取平均值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程。

1.2.3 紅三葉草提取物的制備 稱取已經(jīng)粉碎的紅三草，加入10倍量80%的乙醇回流提取2次（每次2 h），過(guò)濾，合并提取液并減壓濃縮，然后加入5倍量的熱水（85℃以上）攪拌，冷卻至室溫后10000 g離心得到沉淀，加入5倍量的6號(hào)溶劑充分?jǐn)嚢杳撝?次（每次2 h），最后10000 g離心，將沉淀物進(jìn)行干燥得到紅三葉草提取物。

1.2.4 檢出限與定量線 將標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液不斷進(jìn)行稀釋，通過(guò)上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以3倍信噪比（S/N=3）時(shí)的濃度為最低檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）時(shí)的濃度為最低定量限。然后重復(fù)測(cè)定5次最低檢出限和最低定量限濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄峰面積和信噪比。

1.2.5 精密度 取5 μg/mL四種異黃酮的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性 取5 μg/mL四種異黃酮的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按照上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確稱取4份6.25 mg紅三葉草提取物，1份測(cè)定本底值，另外3份分別添加25、12.5 mL和7.5 mL濃度為50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每份樣品加鹽酸甲醇溶液（1 mol/L鹽酸）超聲溶解后定容至50 mL容量瓶，每個(gè)水平制備5個(gè)平行樣品，在上述色譜條件下測(cè)定四種異黃酮的含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果

2.1 洗脫梯度的確定 本研究采用甲醇（A）和10 mmol的磷酸氫二鈉溶液（B）作為流動(dòng)相在不同的梯度洗脫下進(jìn)行洗脫。結(jié)果表明，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A在表1所述的洗脫梯度下分離效果良好，而且保留時(shí)間穩(wěn)定（圖1）。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在210～400 nm波長(zhǎng)進(jìn)行全掃描（圖2）發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆素A和染料木素在270 nm處具有最大吸收峰，281 nm和260 nm處 的吸收峰次 之，254 nm處的吸收峰最小，而大豆苷元和刺芒柄花素的響應(yīng)值則是254 nm＞260 nm＞270 nm＞281 nm。因此，選用270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的光譜圖和其在不同波長(zhǎng)下的HPLC色譜圖

2.3 柱溫的選擇 由圖3可以看出，在上述色譜條件下，柱溫為40℃時(shí)保留時(shí)間最短，吸收峰最大，35℃時(shí)保留時(shí)間次之，吸收峰最小，而30℃時(shí)保留時(shí)間最短，吸收峰僅次于40℃。所以40℃為最佳柱溫。

圖3 大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A在不同柱溫下的HPLC色譜圖

2.4 保留時(shí)間、最低檢出限與最低定量限 四種紅三葉草異黃酮保留時(shí)間、最低檢出限和最低定量限的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的保留時(shí)間為（7.09±0.01）、（7.97±0.01）、（12.12±0.02）min和 （13.60+0.02）min，色譜峰分離效果良好；最低檢出限分別為0.07、0.08、0.10 μg/mL和0.07 μg/mL；最低定量限分別為0.18、0.26、0.40 μg/mL和0.20 μg/mL。

表2 四種異黃酮的保留時(shí)間、最低檢出限和最低定量限

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由表3可知，在濃度為1～50 μg/mL時(shí)，大豆苷元（Y=71654X-30703）、染料木素（Y=71340X+1728）、刺芒柄花素（Y=50078X+29669）和鷹嘴豆素A（Y=75607X+36375）均具有良好的線性關(guān)系，線性方程的R2均大于0.999。

表3 四種異黃酮的線性關(guān)系

2.6 精密度 由表4可知，結(jié)果顯示，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A峰面積的RSD分別為1.80%、1.98%、1.35%和1.72%，表明該方法的精密度良好，符合分析方法對(duì)精密度的要求（李正邦，2016）。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性 由表5可知，看出大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A在常溫下24 h時(shí)內(nèi)峰面積的RSD分別為1.14%、0.90%、1.16%和1.06%，均小于1.2%，表明紅三葉草提取中的這四種異黃酮在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好，符合分析標(biāo)準(zhǔn)的要求（李正邦，2016）。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加標(biāo)回收率 由表6可以看出，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的平均加標(biāo)回 收 率 分 別 為96.24%、100.05%、99.51%和100.18%，RSD分 別 為0.66%、0.94%、0.96%和0.95%，表明該方法具有較高的加標(biāo)回收率，滿足加標(biāo)回收率為80%～120%，RSD＜10%的要求（李正邦，2016）。

表6 加標(biāo)回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 洗脫梯度的確定 異黃酮在梯度洗脫時(shí)的保留時(shí)間和分離效果與有機(jī)相的起始比例密切相關(guān)。有機(jī)相起始比例越小，保留時(shí)間越長(zhǎng)，分離效果越好（劉文靜等，2017；張念等，2011；Krenn等，2002），因此確定甲醇的起始比例為20%。為了在縮短保留時(shí)間的同時(shí)提高分離效果，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在0～5 min將甲醇的比例從20%提高到40%時(shí)大豆苷元和染料木素能夠完美分離，之后在5～20 min內(nèi)將甲醇比例從40%提高到75%時(shí)刺芒柄花素和鷹嘴豆素A也能完美分離。因此確定了上述洗脫梯度，保證四種異黃酮分離后在短時(shí)間內(nèi)洗脫掉其他干擾物質(zhì)，同時(shí)平衡色譜柱，為下一次進(jìn)樣做準(zhǔn)備。

3.2 柱溫的選擇 一般柱溫越高，保留時(shí)間越短，但是溫度過(guò)高會(huì)降低色譜柱的使用壽命，因此文獻(xiàn)中報(bào)道最多的柱溫是30、35、40℃（劉文靜等，2017；Gao等，2015；Urpi-Sarda等，2008）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，40℃時(shí)保留時(shí)間最短，吸收峰最大，35℃時(shí)的保留時(shí)間次之，30℃時(shí)保留時(shí)間最長(zhǎng)，但是35℃時(shí)的吸收峰小于30℃的吸收峰。因此，實(shí)驗(yàn)選擇40℃為最佳柱溫。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 據(jù)報(bào)道，鷹嘴豆素A的最大吸收波長(zhǎng)為260 nm（Delmonte等，2006），也有研究以254 nm和281 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)（李天雪等，2018；張念等，2011；Mustonen等，2006；Krenn等，2002）。在210～400 nm對(duì)鷹嘴豆素A等進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆素A的最大吸收波長(zhǎng)為270 nm，且該波長(zhǎng)下具有良好的精密度和線性關(guān)系，這與Montero等（2018）報(bào)道稱，270 nm處監(jiān)測(cè)時(shí)線性關(guān)系差有所不同。另外，光譜圖和色譜圖顯示染料木素和鷹嘴豆素A的最大吸收波長(zhǎng)均為270 nm，在281 nm和260 nm處具有相同的吸收峰，在254 nm處的吸收峰最小；而大豆苷元和刺芒柄花素的最大吸收波長(zhǎng)為255 nm，281 nm處的吸收峰最小，其次是270 nm和260 nm的吸收峰。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種同時(shí)檢測(cè)鷹嘴豆素A、刺芒柄花素、染料木素和大豆苷元的HPLC檢測(cè)方法，并通過(guò)方法分析學(xué)從線性關(guān)系、檢出限、定量限、穩(wěn)定性、精密度和加標(biāo)回收率等方面對(duì)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果都符合分析標(biāo)準(zhǔn)的要求，可用于同時(shí)檢測(cè)紅三葉草提取物中的四種異黃酮。