高效液相色譜法測定酵素中γ-氨基丁酸

劉宗樂， 張展展， 尤曉亭， 高文惠*， 高林森

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北石家莊 050000；2.河北省農林科學院農業信息與經濟研究所，河北石家莊 050050）

酵素是以動物、植物、菌類等為原料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分的產品（索婧怡等，2020）。酵素中含有多種營養成分，如氨基酸、超氧化物酶、多酚、黃酮類物質以及維生素等。γ-氨基丁酸（GABA）是酵素在發酵過程中所產生的功能性成分之一。研究發現，通過GABAA、GABAB和GABAC這三種受體，GABA可以起到調節情緒（Kose等，2017）、改善睡眠質量（Ahyun等，2021）和增強記憶力（Dashniani等，2020）等作用。此外，GABA在癲癇（Suchitra等，2020）、降血壓（Ngo等，2019）、糖尿病（Li等，2020）以及一些神經系統疾病（Sarasa等，2020）中發揮著有益作用。GABA在畜禽生產中可以提高機體免疫功能、改善產品品質、提高生產性能等（付興周等，2018）。酵素具有多種生理功能，應用于畜禽生產中可發揮諸多有益作用（簡華峰等，2020），有望成為替代抗生素的新型飼料添加劑。目前，酵素作為一種功能性食品，GABA含量也已經作為評價酵素的特征性指標之一。因此，建立一種簡單、靈敏，適用于檢測酵素中GABA含量的方法，對提高酵素產品質量具有參考意義。

高效液相色譜法（HPLC）（Weng等，2021）、比色法（湯彩云等，2018）、氨基酸自動分析儀（李放等，2016）、超高效液相色譜-質譜聯用法（UPLCMS/MS）（秦 宇 等，2020）、 高 效 薄 層 色 譜 法（HPTLC）（Sancheti等，2013）等是目前參考文獻中報道的有關GABA的主要檢測方法。與多數氨基酸一樣，GABA需要通過衍生化處理來實現對目標物質的定量測定，常用的衍生化試劑有鄰苯二甲醛（OPA）（王嘉怡等，2019）、丹磺酰氯（Somasundaram等，2017）、2，4-二硝基氟苯（段智紅等，2019）和異硫氰酸苯酯（李敏等，2015）等。本實驗擬采用OPA作為柱前衍生化試劑，通過單因素實驗，研究衍生時間和衍生溫度的影響，優化并選擇檢測波長、流動相比例和柱溫條件，建立一種簡單、靈敏，適用于酵素中GABA的定量分析方法，并對實際樣品進行檢測，為酵素產品的開發以及評價酵素產品質量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 酵素樣品（自制和市售）；GABA標準品（HPLC≥99%），上海源葉生物科技有限公司；OPA，β-巰基乙醇（99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司；氫氧化鈉、結晶乙酸鈉、冰乙酸、硼酸，均為分析純，天津市永大化學試劑有限公司；實驗室用水為超純水。

1.2 儀器設備Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；UPT-I-10T超純水制備機，四川優普超純科技有限公司；ST3100實驗室pH計，奧豪斯儀器有限公司；KH5200超聲波清洗儀，昆山禾創超聲儀器有限公司；SHB-3A循環水式多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制GABA標準溶液的配制：準確稱取20.0 mg GABA標準品用水溶于10 mL容量瓶中，定容，得到2 mg/mL的母液，并依次稀釋為0.0001、0.0003、0.05、0.1、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的系列標準溶液，置于0～4℃保存備用。

硼酸緩沖液的配制：稱取2.47 g硼酸溶于85 mL水中，用氫氧化鈉調pH=10.4，定容至100 mL，置于0～4℃保存備用。

OPA衍生液的配制：準確稱取10.0 mg OPA，超聲溶解于2.5 mL乙腈中，再加入β-巰基乙醇20 μL，置于0～4℃避光保存。

1.3.2 樣品處理 根據需要將不同酵素樣品稀釋一定倍數后，過0.22 μm有機濾膜，待檢測使用。

1.3.3 衍生方法 由于GABA本身無紫外吸收，故標準溶液和樣品溶液中的GABA需要進行衍生化處理，進而實現定量測定目標物質的目的。本實驗采用OPA作為柱前衍生化試劑，使OPA與GABA在pH=10.4的硼酸緩沖液反應體系下發生衍生化反應，生成具有紫外吸收的物質，但該生成物的穩定性差。因此，實驗對衍生時間和衍生溫度的影響進行了考察。

操作流程：在室溫下，用移液槍分別量取1.3.1配制的硼酸緩沖液600 μL、OPA衍生液120 μL以及GABA標準溶液或樣品溶液120 μL，混合，控制反應時間為2 min，過0.22 μm有機濾膜后，量取20 μL，立即進樣分析檢測。

1.3.4 色譜條件 色譜柱：XBridgeRC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：334 nm；流動相A：乙腈，流動相B：20 mmol/L結晶乙酸鈉溶液（冰乙酸調pH=7.3），A:B=20:80（體積比）；流速：0.8 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：20 μL。

1.3.5 衍生時間的影響 在室溫條件下，選取同一質量濃度的GABA標準溶液進行衍生化處理，控制反應時間分別為1、2、3、4、5、6 min和7 min，按照1.3.4色譜條件快速進樣分析檢測，以考察衍生時間對峰面積的影響。

1.3.6 衍生溫度的影響 選取同一質量濃度的GABA標準溶液分別在室溫、35、45、55℃和65℃下進行衍生化處理，控制反應時間為2 min，按照1.3.4色譜條件快速進樣分析檢測，以考察不同衍生溫度對峰面積的影響。

1.3.7 檢測波長的選擇 按照1.3.3方法對GABA標準溶液進行衍生化處理，衍生化反應所生成的物質在1.3.4色譜條件下經過C18柱分離后進入二極管陣列檢測器進行光譜掃描，得到GABA衍生物的紫外吸收光譜圖后，根據紫外吸收和實際分離情況選擇最適檢測波長。

1.3.8 流動相比例的選擇 在上述最佳衍生條件及固定色譜柱溫度為25℃，且其他色譜條件不變，設置流動相乙腈與20 mmol/L結晶乙酸鈉的體積比為25:75、22:78、20:80和19:81，分別對標準溶液和樣品溶液中GABA進行洗脫分離，考察流動相比例對分離情況的影響，以確定最佳流動相比例。

1.3.9 柱溫的選擇 在上述最佳衍生條件及固定流動相為乙腈-20 mmol/L結晶乙酸鈉溶液（體積比20:80），且其他色譜條件不變，設置柱溫為25、30、35、40℃，分別對標準溶液和樣品溶液中GABA進行分析檢測，考察柱溫對分離效果的影響，以確定最佳柱溫條件。

1.3.10 線性關系與檢出限 在室溫條件下，對1.3.1配 制 的 質 量 濃 度 為0.0003、0.05、0.1、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的系列GABA標 準溶液進行衍生化處理，控制反應時間為2 min，按照1.3.4色譜條件進樣，測得相應質量濃度下GABA衍生物的峰面積，以考察質量濃度與峰面積的線性關系。將GABA標準溶液依次稀釋，采用建立的方法進樣檢測，并以基線噪聲的3倍確定其檢出限。

1.3.11 回收率和精密度的測定 在質量濃度為0.001、0.01、0.1 mg/mL 3個添加水平下，進行加標回收率和精密度實驗。取稀釋一定倍數后的酵素樣品，分別添加上述質量濃度的標準溶液，按照

1.3.3 方法對加標樣品進行衍生化處理，在1.3.4色譜條件下進樣檢測。在上述條件下，各加標樣品重復進樣5次，記錄數據，根據線性回歸方程計算回收率和相對標準偏差。

1.3.12 實際樣品的測定 采用實驗建立的方法分別對6種自制或市售的酵素樣品進行檢測，根據所測得的峰面積，計算樣品中GABA的含量。

2 結果與分析

2.1 衍生時間的影響 由圖1可知，在所考察的衍生時間范圍內，當衍生時間增加，GABA衍生物的峰面積總體呈現先增加后降低的變化趨勢。在衍生時間為2 min時，檢測靈敏度最高，對應GABA衍生物峰面積最大。因此選取2 min作為衍生化時間，且實驗需要快速進樣。

圖1 衍生時間對GABA衍生物峰面積的影響

2.2 衍生溫度的影響 由圖2可知，在不同衍生溫度下，對應GABA衍生物峰面積間有著明顯差異。在所考察的衍生溫度范圍內，當衍生溫度升高時，由于OPA與GABA的衍生化產物穩定性較差，GABA衍生物的峰面積呈下降的變化趨勢。因此，選取室溫作為最佳衍生化溫度。

圖2 衍生溫度對GABA衍生物峰面積的影響

2.3 檢測波長的選擇GABA衍生物經C18柱分離后進入二極管陣列檢測器在210～400 nm內進行光譜掃描，結果見圖3。GABA衍生物有2處特征吸收，分別為228 nm和334 nm。在最佳衍生條件下，設置波長分別為228 nm和334 nm，固定其他色譜條件不變，進樣分析檢測。發現在GABA衍生物響應值高的228 nm波長下，干擾峰較多。考慮紫外吸收和實際分離情況，選擇334 nm作為檢測波長。

圖3 GABA衍生物的紫外光譜掃描圖

2.4 流動相比例的選擇 實驗考察了流動相乙腈與20 mmol/L結晶乙酸鈉為不同比例時，酵素樣品中目標物質與其他成分的分離情況。酵素樣品在4種流動相比例（乙腈與20 mmol/L結晶乙酸鈉的體積比為25:75、22:78、20:80和19:81）下的高效液相色譜分離圖如圖4所示。結果表明，當流動相中乙腈比例從25%到19%的過程中，隨著乙腈比例的降低，目標物質的保留時間逐漸增長。當流動相A與B比例為25:75時，樣品中雜質與目標物質的色譜峰重疊嚴重；當流動相A與B比例為22:78時，目標物質與雜質色譜峰不能完全分離；當流動相A與B比例為20:80時，目標物質可以實現基線分離，且無拖尾現象；當流動相A與B比例為19:81時，樣品中雜質與目標物質的色譜峰完全分離，但分析時間較長。綜合考慮，選擇體積比為20:80的乙腈-20 mmol/L結晶乙酸鈉作為流動相。

圖4 流動相比例的選擇

2.5 柱溫的選擇 實驗考察了不同柱溫條件下，酵素樣品中目標物質與其他成分的分離情況。酵素樣品在4種柱溫（25、30、35℃和40℃）條件下的高效液相色譜分離圖如圖5所示。結果表明，當色譜柱溫度為40℃和35℃時，樣品中雜質與GABA衍生物的色譜峰分離效果不佳。當色譜柱溫度為30℃和25℃時，目標物質均可以實現基線分離。雖然在柱溫30℃較25℃時，目標物質的保留時間有所提前，但考慮到樣品基質的影響，為確保樣品中雜質與GABA衍生物更好的分離，選用接近室溫的25℃作為柱溫。

圖5 柱溫的選擇

2.6 線性關系與檢出限 按照1.3.10方法對GABA質量濃度與峰面積的線性關系進行考察，以質量濃度為橫坐標（x），以峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線（圖6）。GABA標準品的高效液相色譜圖見圖7。質量濃度在0.3 μg/mL～1 mg/mL線性關系好（R2=0.9997），并且線性范圍寬，線性回歸方程為y=11245x-73.995。以信噪比S/N=3確定檢出限為0.1 μg/mL。

圖6 GABA衍生物的標準曲線

圖7 GABA標準品的HPLC色譜圖

2.7 回收率和精密度的測定 按1.3.11方法進行回收率和精密度實驗，結果見表1。酵素樣品的平均加標回收率為92.17%～104.29%，相對標準偏差（RSDs）為0.51%～3.99%（n=5）。結果表明，實驗建立的方法準確度和精密度良好，分析方法可靠，且適用于酵素產品中GABA含量的檢測。

表1 方法的回收率和精密度（n=5）

2.8 實際樣品的測定 按照1.3.12方法分別對自制和市售的6種酵素樣品進樣檢測，并計算樣品中GABA的含量，結果見表2。結果表明，所測6種酵素樣品中均含有GABA，且含量在0.036～0.567 mg/mL。由于所測酵素樣品原材料、發酵工藝等方面的不同，使各酵素樣品間GABA的含量具有明顯差異。6種酵素樣品的高效液相色譜分離圖，如圖8所示。結果表明，采用實驗建立的方法，酵素樣品中目標物質與其他成分具有良好的分離效果，而且該檢測方法較其他方法簡單（湯彩云等，2018）、靈敏（李雁琴，2020；陳雪等，2017；李璐，2016）。

圖8 酵素樣品的HPLC色譜圖

表2 6種酵素樣品中GABA含量mg/mL

3 結論

本實驗結果表明，以OPA作為衍生化試劑，在室溫下進行衍生化處理，控制反應時間為2 min，按照檢測波長334 nm，流動相為乙腈-20 mmol/L結晶乙酸鈉溶液（體積比20:80），柱溫25℃，流速0.8 mL/min的色譜條件快速進樣分析檢測，目標色譜峰分離效果好，質量濃度在0.3 μg/mL～1 mg/mL線性關系好（R2=0.9997），且線性范圍寬，檢出限為0.1 μg/mL，準確度和精密度良好，所檢測的6種酵素樣品中GABA含量在0.036～0.567 mg/mL，不同酵素樣品間GABA含量具有明顯差異。實驗建立的方法簡單、靈敏、準確可靠，適用于酵素產品中GABA含量的檢測。