60Co-γ射線輻照對粉黛亂子草種子萌發及幼苗生長的影響

姜恒越, 高毓翎, 李媚晴, 陳志龍, 莊黎麗, 楊志民, 張夏香

(南京農業大學， 江蘇 南京 210095)

輻射誘變育種是利用γ射線、β射線、X射線、中子、紫外線、激光等物理誘變源，誘發植物DNA變異和染色體畸變，引起植物形態結構和生理生化等多方面的變異，從而創制新種質的方法[1-4]。其中，γ射線因其穿透力好、成本低、突變率高、變異范圍廣等優勢，被廣泛應用于作物、園藝以及林木育種，已成為改良農業新品種的重要途徑之一[5-7]。目前，輻射誘變育種工作面臨的最主要問題是最佳輻照劑量的選擇，不同的植物種類、同種植物的不同品種、同一植物的不同發育階段及不同器官的最佳輻照劑量均存在顯著差異，選擇合適的輻射劑量是保證輻射誘變育種效率的重要前提[8-10]。

粉黛亂子草(Muhlenbergiacapillaris(Lam.) Trin.)，又名毛芒亂子草，為禾本科(Gramineae)亂子草屬植物，是一種多年生暖季型觀賞草，其圓錐花序龐大、繁密，花期長，粉紫色花穗如發絲從基部長出，遠看如紅色云霧，花群顏色美觀、質地獨特，目前被廣泛應用于國內外園林景觀，打造特色花境[11]。粉黛亂子草自然分布于美國中西部，生長于草地、荒原或開闊林地的沙礫土壤中，喜光、耐半陰、耐干旱、耐鹽堿，且具有抗病性強、維護成本低的特性[12]。目前，國內外粉黛亂子草品種單一，針對粉黛亂子草的研究也主要集中于園林應用、鑒定評價以及養護管理技術等方面[13-17]，關于粉黛亂子草新品種選育進展甚緩，無法滿足日益增加的粉黛亂子草市場需求。因此，探索60Co-γ射線輻射誘變對粉黛亂子草種子萌發及幼苗生長的影響，可為粉黛亂子草輻射誘變育種提供理論參考。本研究采用粉黛亂子草干種子為實驗材料，設置5個不同輻射劑量處理，測定種子萌發及幼苗生長相關指標，為粉黛亂子草輻射誘變新種質創制提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以粉黛亂子草‘粉黛’品種為材料，由北京市農林科學院草業花卉與景觀生態研究所提供，種子于11月底收獲后經自然風干、脫粒，選用紙信封盛裝，儲存備用。

1.2 實驗設計與處理

1.2.160Co-γ射線輻照 利用南京航空航天大學輻照中心60Co-γ射線源，對挑選出的完整飽滿的粉黛亂子草干種子(種子含水量約為10%)進行輻照處理，設置5個劑量梯度，分別為100,200,300,400和500 Gy，輻射劑量率為1.08 Gy·min-1，以未經輻照的種子為對照。

1.2.1發芽試驗 選取各輻射劑量處理與對照處理過的粉黛亂子草種子各400粒，每個劑量4個重復，每個重復100粒種子，蒸餾水浸泡24 h后，用體積分數為75%的酒精消毒30 s，蒸餾水沖洗3次，再用質量分數為2%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，蒸餾水沖洗3次。將消毒后的種子置于鋪有一層濾紙的培養皿中，在人工氣候室中培養，胚芽長度達到種子長度一半時視為發芽。人工氣候室環境條件設置為：晝夜溫度為23℃/20℃，晝夜周期為14 h/10 h，相對濕度控制在70%，光照強度為300 μmol·m-2·s-1。每天固定時間采用稱重法進行補水，計數種子發芽情況。于第10天計算種子發芽勢，第21天萌發實驗結束時計算種子的發芽率。于發芽試驗最后一天，使用游標卡尺測量胚軸至胚芽尖端、胚軸至胚根尖端的長度，精確到0.01 cm，分別記作胚芽長、胚根長。計算方法如下：

發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)，Gt指時間t的種子發芽數，Dt指相應的發芽試驗天數。

1.2.2幼苗試驗 發芽試驗結束后，選取每個輻射劑量處理具有代表性的幼苗，采用96孔植物水培盒于人工氣候室進行水培培養，晝夜溫度為23℃/20℃，晝夜周期為14 h/10 h，相對濕度控制在70%，光照強度為650 μmol·m-2·s-1；先以1/8標準濃度的Hoagland植物水培營養液[18]緩苗一周后，采用1/4標準濃度的Hoagland植物水培營養液繼續培養。每周使用游標卡尺測量幼苗的株高及根長。

植物水培盒培養三周后，轉入周轉箱繼續進行六周的水培培養，采用1/2標準濃度的Hoagland植物水培營養液培養，人工氣候室培養條件不變。每周測量植株株高、葉寬、分蘗數、總葉數、綠葉數及根長。

1.3 根系形態指標測定

水培培養最后一天(苗齡91天)時，將各輻射劑量處理與對照處理具有代表性的粉黛亂子草植株根系洗凈后，用掃描儀(EPSON，12000XL，日本)掃描根系，使用WinRHIZO軟件(V5.0，加拿大)進行根系形態指標分析，分析指標包括：總根長(cm)、根表面積(cm2)、根體積(cm3)及根平均直徑(mm)。

1.4 數據處理與統計分析

為了綜合評價不同輻射劑量對粉黛亂子草種子萌發及幼苗生長的影響，本研究運用隸屬函數法對各處理下粉黛亂子草的形態指標進行綜合分析，計算公式：y=(xa-xmin)/(xmax-xmin)，其中：xa代表某一指標在某處理下的值，xmax和xmin分別代表同一指標中在不同處理下的最大值與最小值。

采用SPSS 21.0軟件對所測數據進行方差分析，對不同處理的數據選用單因素ANOVA分析處理，用Duncan法進行差異顯著性檢驗(P< 0.05)；采用Sigmaplot(14.0，美國)作圖。

2 結果與分析

2.1 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草種子萌發的影響

隨著60Co-γ射線輻射劑量的升高，各項發芽指標均呈現出先上升后下降的趨勢(表1)。在200～400 Gy輻射劑量范圍內，粉黛亂子草的發芽率及發芽指數均顯著高于對照(P< 0.05)。當輻射劑量為400 Gy時，發芽率達到最大值(87.25%)；而500 Gy的輻照處理則顯著降低了發芽率(68.75%)和發芽指數(7.72)。300 Gy及400 Gy的輻照處理顯著提高了粉黛亂子草種子的發芽勢(P< 0.05)，而當輻射劑量達到500 Gy時，發芽勢為最小值(49.50%)。這表明適量的輻射處理(200～400 Gy)能促進粉黛亂子草種子萌發，但過高劑量的輻射處理(500 Gy)則顯著抑制了種子萌發。

表1 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草種子萌發的影響Table 1 Effects of different 60Co-γ radiation doses on seed germination of Muhlenbergia capillaris

隨著輻射劑量的增加，粉黛亂子草的胚芽長度呈先升高后降低的趨勢。當輻射劑量為100 Gy時，胚芽長度達最大值；在輻射劑量超過100 Gy后，隨著輻射劑量的增加，粉黛亂子草胚芽長度逐漸降低，當輻射劑量達到400 Gy時，其胚芽長度均值約為對照組的1/2；當輻射劑量達到500 Gy時，其胚芽長度均值約為對照組的1/6。粉黛亂子草胚根長度則隨輻射劑量增加呈逐漸降低的趨勢，當輻射劑量為100 Gy時，胚根長度比對照減小了0.77 mm；當輻射劑量為500 Gy時，胚根長度受輻射的抑制作用較為明顯，該輻射劑量下的胚根長度僅為對照組的1/3。以上結果表明，輻射處理顯著抑制了粉黛亂子草胚根生長，而低輻射劑量能促進胚芽生長，高輻射劑量抑制胚芽生長。

2.2 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草幼苗生長的影響

60Co-γ射線輻照處理對粉黛亂子草幼苗長勢、株高、根長的影響圖1所示。輻照劑量達到500 Gy時，粉黛亂子草成苗率低于2%，因此，幼苗形態指標測定僅包括0，100，200，300及400 Gy 5個處理。苗齡為28天時，100 Gy處理的粉黛亂子草株高及根長均為最大值；苗齡為35天及42天時，對照組的株高均高于各輻照處理下幼苗株高，且隨著輻射劑量的增加，粉黛亂子草的株高及根長逐漸降低，輻射劑量為400 Gy時，株高及根長均為最低值。因此，較低的輻射劑量(100 Gy)對早期幼苗株高及根長有一定的促進作用，但過高的輻射會抑制株高和根長的增加。

圖1 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草幼苗株高和根長的影響Fig.1 Effects of different 60Co-γ radiation doses on plant height and root length of Muhlenbergia capillaris seedlings

2.3 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草植株形態指標的影響

隨著植物生長周期推移，粉黛亂子草植株株高、根長、葉寬、總葉數、綠葉數及分蘗數均呈現逐漸升高的趨勢(圖2)。與對照相比，各輻照處理均顯著降低了粉黛亂子草植株的株高及葉寬，且隨著輻射劑量的增加呈現逐漸降低的趨勢，400 Gy達最低值。苗齡為91天時，與對照相比，100～400 Gy輻照處理下株高降低了19.03%～56.47%，根長降低了8.28%～37.96%，總葉數降低了18.41～26.49%，綠葉數降低了20.30%～28.82%，分蘗數減少了21.92%～43.64%。

圖2 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草植株形態的影響Fig.2 Effects of different60Co-γ radiation doses on morphology of Muhlenbergia capillaris plants

2.4 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草根系形態指標的影響

粉黛亂子草總根長隨輻射劑量增加呈先增加后減小的趨勢(圖3)，輻射劑量為100 Gy時根長達最大值，但與對照處理差異不顯著；當輻射劑量達到200 Gy及以上時，隨著輻射劑量的增加，粉黛亂子草總根長逐漸降低；當輻射劑量達到400 Gy時，粉黛亂子草總根長比對照降低了55.42%。根表面積、根體積受輻射劑量影響的變化趨勢與總根長基本一致，輻射劑量為100 Gy時粉黛亂子草根表面積與根體積分別增加了22.08%與6.46%，而輻射劑量200～400 Gy下粉黛亂子草根表面積與根體積顯著下降，當輻射劑量達到400 Gy時，根表面積與根體積分別僅為對照的29.34%及19.79%，表明輻射劑量達400 Gy對根體積及根表面積有極強的抑制作用。相對于總根長、根表面積及根體積，輻照對粉黛亂子草根平均直徑的影響較小，僅當輻射劑量達到400 Gy時，粉黛亂子草根平均直徑較對照顯著降低(—34.94%)。

圖3 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草根系形態的影響Fig.3 Effects of different 60Co-γ radiation doses on root morphology of Muhlenbergia capillaris plants

2.5 隸屬函數綜合分析

為了綜合評價不同60Co-γ輻射劑量對粉黛亂子草種子萌發及幼苗生長的影響，對不同處理下粉黛亂子草的種子萌發相關指標(發芽率、發芽勢、發芽指數、胚芽長度、胚根長度)、植株形態指標(株高、根長、葉寬、總葉數、綠葉數、分蘗數)及根系形態指標(總根長、根表面積、根體積、根平均直徑)進行了隸屬函數分析，計算總得分，結果表明0 Gy>100 Gy>200 Gy>300 Gy>400 Gy，表明本研究的輻照處理(100～400 Gy)均不同程度地影響了粉黛亂子草植株的長勢(表2)。

表2 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草種子萌發及幼苗生長的隸屬函數分析Table 2 Subordinate function analysis for the effects of different60Co-γ radiation doses on seed germination and seedling growth of Muhlenbergia capillaris

2.6 粉黛亂子草干種子60Co-γ輻照半致死劑量計算

統計不同劑量處理下粉黛亂子草的成苗率，利用線性回歸方程式繪制標準曲線，可得標準曲線方程為y=0.16x+5.03，R2=0.87(圖4)，計算求得：粉黛亂子草干種子受60Co-γ輻射的半致死劑量為274.03 Gy。

圖4 60Co-γ輻射劑量與粉黛亂子草死亡率的線性回歸分析Fig.4 Univariate linear regression between radiation dose and death rate of Muhlenbergia capillaris

3 討論

誘變劑量的選擇對于誘變育種至關重要，輻射劑量過高則存活率降低，失去選擇機會，而劑量過低則誘變效果不佳，獲得突變體的概率大大減少[19-20]。本研究對粉黛亂子草60Co-γ射線的輻射敏感性分析發現，不同輻射劑量對粉黛亂子草種子萌發及幼苗生長的影響各異。經不同劑量60Co-γ射線輻射處理后，粉黛亂子草種子的萌發率、發芽勢、發芽指數均在一定程度上呈現先升高后降低的變化趨勢。在輻射劑量300～400 Gy之間，萌發指標可以達到峰值，當輻射劑量達到500 Gy時，各項發芽指標急劇下降。在一定范圍內的低劑量輻照可以提高粉黛亂子草種子萌發的相關指標，但超過了一定的輻射劑量則會對種胚造成傷害，顯著抑制種子萌發。彭夢婕等[21]針對60Co-γ射線對紫薇種子萌發、幼苗生長的研究中，也發現了低劑量的輻照處理(100 Gy)對種子的發芽率、發芽勢和發芽指數均有一定的促進作用，而較高劑量的輻照(180 Gy)則會顯著影響種子的成苗率。低劑量輻照可能通過提高種子的新陳代謝水平，促進種子的萌發，而高劑量輻射則可能破壞細胞膜結構、激發自由基積累、改變種子內多種生理生化作用，影響種子活力[8,22]。

植株形態指標是評價粉黛亂子草等觀賞草的重要評價標準，植株的株高、葉寬、葉片數量、分蘗數等指標都具有評價價值。本研究發現，60Co-γ射線輻照雖然促進了種子萌發進程，但隨著幼苗生長發育，輻照處理均不同程度地影響了植株各形態指標，降低了株高、根長、葉寬、總葉數、綠葉數及分蘗數，其中100 Gy影響較小。劉淑霞等[23]在對紫花苜蓿的研究中也發現，隨著60Co-γ輻射劑量的增加，紫花苜蓿的發芽率、出苗率、株高、株干質量、株鮮質量及葉綠素含量均顯著下降。唐昌亮等[24]在對洋紫荊的研究中發現當60Co-γ輻照超過一定范圍時，植株幼苗生長的大多數指標都會出現顯著抑制，但一定程度上提升突變率，有利于后續對突變體的進一步篩選。

根系是植物吸收水分及養分的主要器官，其形態結構(根長、表面積、體積等)直接影響植物生長發育、生物產量及植物應對環境變化的能力[25-26]。李春牛等[22]發現，輻照處理顯著影響了茉莉花種子生根，隨著輻照劑量的增加，種子的生根率及根長均呈下降趨勢，不同處理間差異極顯著(P<0.01)。袁帥等[8]發現50 Gy處理下扁穗雀麥幼苗根長略高于對照(P>0.05)，而輻射劑量超過100 Gy后，根系長度顯著下降；根系表面積和體積的變化均與輻射劑量的變化呈反比，根系平均直徑在60Co-γ輻射處理下與對照間無明顯差異。本研究中，100 Gy處理下粉黛亂子草總根長、根表面積略高于對照，但差異不顯著；輻照劑量超過100 Gy后，總根長、根表面積、根體積顯著下降；除400 Gy外，其余各處理均未顯著影響根平均直徑，這與前人的研究基本一致，表明根平均直徑受輻照影響較小，輻照對根系形態的影響主要集中于根長、根體積與根表面積。

4 結論

低劑量的60Co-γ射線輻照對粉黛亂子草種子萌發具有一定的促進作用，提高了種子的發芽率及發芽勢；但隨著粉黛亂子草生長發育進程推進，植株大部分生長指標均受輻照影響，呈現了逐漸下降的趨勢。在根系形態指標方面，100 Gy輻照促進了根表面積和根體積的增加，200～400 Gy則顯著抑制了總根長、根表面積及根體積。通過致死率-輻射劑量回歸方程計算得出，粉黛亂子草干種子受60Co-γ輻射的半致死劑量為274.03 Gy。該研究結果可望為粉黛亂子草輻射誘變及粉黛亂子草新種質創制提供一定的數據支撐和理論參考。