一株沙福芽孢桿菌的耐受性研究

張海艷，楊偉平，楊婷婷

（洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471934）

近幾年化學肥料的過量施用使得農作物對各種病蟲害的抵抗能力越來越弱，導致農作物產量下降，品質降低[1-2]。在建設和發展綠色農業的新思路和新模式下，需創新和發展新的施肥技術，減少化學肥料的施用量。生物堆肥主要是在農作物秸稈中加入益生菌發酵制成的肥料，適用于各種土壤，可增加土壤中有機物的含量、改善土壤通透性、提高地力，有利于農作物生長[3]。實施微生物堆肥技術，對挖掘有機肥新肥源、增強農作物抗性、提高農作物產量等都具有十分重要的意義[4-6]。芽孢桿菌屬于細菌的一科，是一種常用的微生態制劑，其形成的芽孢對環境有很高的抗逆性，對高溫、強酸和強堿都有一定的耐受能力。沙福芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，應用廣泛，除應用于產IAA、固氮、溶磷[7]、產纖溶酶[8]和微生態飼料制劑[9]外，還應用于草魚養殖水質調控、生物防治植物病害[10]、修復土壤重金屬污染等方面[11]。袁慎亮等[8]篩選出一株能降解纖維蛋白的沙福芽孢桿菌，是一株新的纖溶酶產生菌，纖溶酶有較好的活性及穩定性，具有潛在的開發價值。徐同偉等[10]把沙福芽孢桿菌應用到生物防治病害方面，篩選出的沙福芽孢桿菌對煙草具有優良的防病和促生長作用，在降低煙草黑脛病危害和提高煙草產量方面具有重要作用，在對峙培養中沙福芽孢桿菌對煙草黑脛病菌絲的相對抑制率是72.99%，在盆栽試驗中沙福芽孢桿菌對煙株生物量有明顯的促生長作用，對煙草黑脛病的平均防治效果為80.06%。田群等[11]將沙福芽孢桿菌應用到修復土壤重金屬（錳）污染方面，發現其修復效果好、成本低。但在農業生產中芽孢桿菌存在發酵周期較長、芽孢形成率較低、成本高等問題。基于以上，本文以沙福芽孢桿菌為研究對象，對其生長特性、耐酸堿性、耐熱性及對抗生素的耐性進行了研究，并探究使該菌株芽孢形成率及芽孢數量最大化的培養條件。

1 試驗材料

1.1 菌株

沙福芽孢桿菌由洛陽師范學院生命科學學院動物營養與健康研究室提供。

1.2 培養基

LB固體培養基、LB液體培養基及發酵培養基參照文獻配制[12-13]。

2 試驗方法

2.1 菌種活化

在超凈工作臺上用滅過菌的接種環挑取實驗室保存的適量菌種，用平板劃線法接種到無菌LB固體培養基中，在恒溫培養箱中培養24 h。挑取單個菌落到LB液體培養基中，在37 ℃、220 r/min條件下搖床培養12 h。

2.2 種子液制備

吸取活化后的菌液1 ml，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，加1 ml PBS搖勻后離心2 min，棄上清液，加1 ml PBS搖勻后用酶標儀測OD值，取OD600=0.5的菌液為種子液。

2.3 生長曲線制備

取種子液以1%的量接種至LB液體培養基，在37 ℃、轉速220 r/min的搖床中培養6 h后測OD600值，以后每隔4小時吸取1 ml菌液測OD值，制備菌種的生長曲線。

2.4 計算不同溫度水浴后的活菌數和存活率

將培養菌液分別放置于不同溫度（37 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃）的水浴鍋內加熱10 min，以常溫下的發酵培養液為空白對照，計算不同溫度水浴后的活菌數和存活率。

2.5 計算不同pH值下的活菌數和存活率

吸取1 ml在中性條件下培養的菌液分別接種于pH值為2、4、6、7、8、9、10的不同發酵培養基中，37 ℃、220 r/min條件下搖床培養2 h，測量活菌數和存活率。

2.6 測定不同裝液量下的活菌數

將種子液接種到不同裝液量（25 ml、50 ml、75 ml、100 ml、125 ml、150 ml）的發酵培養液中，37 ℃、220 r/min條件下搖床培養12 h，測量不同裝液量下的活菌數，然后將不同裝液量的培養菌液放置于80 ℃的水浴鍋內加熱10 min，測定芽孢數。

2.7 計算不同初始pH值下的產孢率

參照文獻將pH為7作為空白對照組[14-16]，將種子液接種到初始pH為5.5、6、6.5、7、7.5、8的培養液中，搖床培養12 h后測量活菌數和芽孢數，并計算芽孢率。

2.8 計算不同培養時間下的活菌數和產孢率

設置培養時間為6 h、12 h、24 h、36 h、48 h，在不同培養時間后測量菌株的活菌數和芽孢數，并計算芽孢率。

2.9 判定抗生素對沙福芽孢桿菌抗逆性的影響

將赤霉素、硫酸鏈霉素、硫酸卡那霉素3種抗生素稀釋成不同濃度的溶液[17]，先往培養皿中傾注一定量的菌液和稀釋后的抗生素，然后加入40 ℃左右的LB固體培養基，并迅速混勻，培養基凝固后放入恒溫培養箱中培養24 h。分別計算菌落數，菌落數少于5個的藥物濃度為菌株的最大耐受濃度。

3 結果與分析

3.1 生長曲線

從圖1可以看出，菌落培養6～22 h時菌株生長速度最快，呈指數增長，此時生長速度大于死亡速度。菌株培養22～30 h時處于生長穩定期，生長速度等于死亡速度，但此時活菌數最多。培養時間為30～50 h時菌體死亡速度大于生長速度，菌株數量明顯下降。

3.2 溫度對活菌數和存活率的影響

從圖2可以看出，隨著溫度的升高，沙福芽孢桿菌的活菌數和存活率均逐漸下降，但在處理溫度為90 ℃和100 ℃的高溫條件下存活率分別為84.7%和84%，可見沙福芽孢桿菌具有較好的耐高溫能力。傳統的高溫堆肥發酵溫度為55～60 ℃，近年來快速發展的超高溫堆肥技術的顯著特點是溫度高，最高溫度達93.4 ℃[18]。從對溫度的耐受力方面來看，沙福芽孢桿菌既能用于傳統的堆肥技術，也能用于現代的超高溫堆肥技術。

圖2 溫度對活菌數和存活率的影響

3.3 pH對活菌數和存活率的影響

從圖3可以看出，隨著pH的升高，沙福芽孢桿菌的活菌數和存活率都呈現先升高后降低的趨勢，pH為7時活菌數和存活率均達到最高水平，在pH為2和10的條件下培養2 h后存活率分別為85.3%和83.8%，說明沙福芽孢桿菌具有較強的酸堿耐受能力。

圖3 pH對活菌數和存活率的影響

3.4 裝液量對活菌數和產孢率的影響

從圖4可以看出，裝液量為150 ml時產孢率最大，但活菌數量不是最大；裝液量為100 ml時能獲得最大活菌數；裝液量為125 ml時能獲得最大芽孢數。故以125 ml為最適裝液量。

圖4 裝液量對活菌數和產孢率的影響

3.5 初始pH對活菌數和產孢率的影響

從圖5可以看出，在一定范圍內芽孢數隨著pH的升高而升高，當pH為7時能獲得最大芽孢數，pH大于7時芽孢數開始下降，故最適初始pH值為7。

圖5 初始pH對活菌數和產孢率影響

3.6 培養時間對活菌數和產孢率的影響

從圖6可以看出，活菌數隨著培養時間的增加先增加后減少，活菌數和芽孢數均在培養24 h時達到最大，故以24 h為最佳培養時間。

圖6 培養時間對活菌數和產孢率的影響

3.7 抗生素對沙福芽孢桿菌抗逆性的影響

從表1可以看出，沙福芽孢桿菌對高濃度的赤霉素有抗性，對低濃度的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素有抗性。

表1 沙福芽孢桿菌對抗生素的耐受性

4 結論與討論

該株芽孢桿菌的最佳產孢條件為培養溫度37 ℃、培養時間24 h、初始pH=7、裝液量125 ml，在此條件下菌株的芽孢數和活菌數均能達到最大；該菌株對赤霉素、硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素均具有一定的抗性。雖然通過優化培養條件能夠提高沙福芽孢桿菌的芽孢形成率，緩解化學肥料造成的環境污染問題，但真正將微生物應用于生物堆肥時能源物質和營養供應直接影響其在土壤中的繁殖。為實現復合微生物堆肥的廣泛應用，還需進一步深入研究不同土壤對芽孢萌發的影響，提高微生物對土壤的適應性、有效性和長效性。