免疫分析技術在農藥殘留快速檢測中的應用及研究進展

唐 牧 邵 丹

（新疆石河子市疾病預防控制中心，新疆 石河子 832000）

農作物中的農藥殘留會直接通過食物進入到人體內，在環(huán)境中殘留的農藥會被動地被植物吸附，然后通過食物鏈漸漸地進入到人體內。長期的農藥殘留會對人體健康帶來負面影響，甚至直接破壞生態(tài)環(huán)境，影響到我國的出口經濟，對中國社會發(fā)展也會造成巨大損失。為此，當前利用免疫分析技術對農藥殘留快速進行檢測，能夠幫助我國社會提高發(fā)展的整體速度。

1.免疫分析技術中抗原和抗體

在選擇免疫分析技術時，首先要考慮到是抗原和抗體的制備技術。免疫分析技術一直以來都是以抗原、抗體的特異性結合作為基礎，抗原、抗體的制備質量可謂是免疫分析過程中的關鍵和基礎步驟。

1.1 抗原的制備

在進行抗原制備過程中，其主要是由于農藥小分子與大分子物質發(fā)生反應。通過反應才能夠激發(fā)動物產生抗體的產生，進而測量農藥。但是在進行農藥小分子測量過程中，需要確保小分子能夠與大分子物質發(fā)生反應，具有活性基團，只有該基團能夠始終保持著待測量物品的空間構型和電子分布半抗原，才能夠確保在實際進行反應過程中，反應質量得到提升。在這個過程中需要考慮到理想的半抗原大多數(shù)情況下具備待測動物的結構特征。特別是待測動物的立體化學特征，而另外一方面理想半抗原與載體蛋白進行連接之后，能夠保證半抗原特征結構最大限度地被免疫活性細胞識別和結合，同時也能夠展現(xiàn)出抗原決定簇，更可以根據不同農藥的實際需求，制備更加具有預期性和親和性的抗體。包被原免疫原結構會對免疫分析特征性和靈敏性產生一定的影響，為此，在進行抗原的制備過程中，應做到針對一種分析目標，最好使用不同的半抗原以及不同的免疫檢測方法進行檢測，能夠提高檢測效果，同時也可以實現(xiàn)與載體蛋白的偶聯(lián)，減少在免疫分析過程中存在的誤差。做到橋與長臂的抗體與包被原的特異性結合，提高結合的質量并且增強免疫分析技術的特異性以及靈敏性。

1.2 抗體的制備

在抗體的制備過程中則需要考慮到不同階段，分別是多克隆抗體階段、單克隆抗體階段以及基因工程抗體階段。

分析多克隆抗體階段時，應考慮到多克隆抗體階段，主要是來源于免疫動物直接產生的，這是免疫分析過程中最簡單并且應用時間長的一種抗體制備方法。單克隆抗體在進行制備的過程中，其主要利用的是免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞進行融合，能夠篩選出穩(wěn)定分泌目標物抗體的細胞株，并且通過該細胞中進行開發(fā)。多克隆抗體和單克隆抗體相比較而言，單克隆抗體具有的獨特優(yōu)勢在于可以無限量地去生產抗體，而多克隆抗體在使用過程中即便是針對同一只動物，由于采血的批次不同，動物中的抗血清存在著明顯的差異性。根據近幾年世界各地對于農藥殘留快速檢測分析報告中進行分析，可以能發(fā)現(xiàn)單克隆抗體所占比例在逐年增加，但是無論是選擇多克隆抗體的制備方式或是單克隆抗體的制備方式，其均存在著一個問題，就是所需要消耗的制備時間較長，并且費用較高，基因工程抗體工程應用的方式是利用DNA技術對其進行重組，通過基因突變以此來改造某一種抗體的基因序列編碼，在自然界中可以制造出更多原本在自然界中不存在的蛋白質分子，通過重組抗體技術，例如噬菌體的顯示發(fā)展，能夠實現(xiàn)克隆生產抗體一目標，而這些片段本身具有完整的抗體功能，并且能夠在生長繁殖迅速的大腸桿菌中進行表達，其直接縮短了制備抗體所需要消耗的時間。利在當前的基因抗體工程應用過程中最常見的抗體片段包括了。Scfv、fab與完整的LgG分子相比較而言，Scfv、fab片段本身的特異性更高，而重組抗體的存在不僅僅加速了不依賴于動物抗體的發(fā)展，同時在農藥材料分析領域發(fā)展速度越來越快，并且得到良好的應用以及分析效果。

2.免疫分析技術在農藥殘留快速檢測中的應用

2.1 化學發(fā)光免疫分析方法

在分析化學發(fā)光免疫分析方法時發(fā)現(xiàn)，其主要包括了以下兩種不同的方式：

2.1.1 化學發(fā)光免疫分析法

化學發(fā)光免疫分析也稱CLIA法，其主要的原理是利用在抗體或者是抗原上進行標記化學發(fā)光劑，進而形成的特異性免疫反應。在后續(xù)進行農藥檢測的過程中，其主要是通過獲取已經完成標記的分子，對其進行化學發(fā)光反應，并分析在整個反應的過程中，所展現(xiàn)的化學發(fā)光強度，根據強度推斷在本次樣品中被標記抗體或者是抗原本身的含量。在實際檢測的過程中，能發(fā)現(xiàn)其中包括的、常用的化學發(fā)光標記物為以下幾種分別是：魯米諾、異魯米諾以及其衍生物、氨丁基乙基異魯米諾、氨己基乙基異魯米諾、鄰苯三酚和吖啶酯類等等。

2.1.2 化學發(fā)光免疫分析法的優(yōu)、缺點

在使用化學發(fā)光免疫分析法時，發(fā)現(xiàn)該方法具有以下幾種不同的優(yōu)點，分別是：第一，使用這種方式其檢測的結果具有極強的準確性并且整體的精密度高，檢測結果可以和放射免疫分析法即RIA相媲美；第二，化學發(fā)光免疫分析法靈敏度高，在使用的過程中，其反應速度較快，甚至超越RIA分析法；第三，整體消耗的檢測時間較短；第四，在實驗反應的過程中，所有使用的試劑均處于無毒性，并且整體的性質十分地穩(wěn)定；第五，本次實驗的過程中，可以在短時間內實現(xiàn)自動化測定；第六，該方法的適用性廣。但是化學發(fā)光免疫分析法也存在一定的缺點，其中包括了以下幾點：第一，抗原或者是抗體在被標記過發(fā)光物質后，會直接改變該物體的免疫反應性能，并且使用該發(fā)光劑進行標記的過程中，其標記率重現(xiàn)性較差。

2.1.3 化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法

化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法是基于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析進行改進的一種方式，在傳統(tǒng)的檢測過程中，其酶的活性一般情況下是通過熒光法或催化光度法進行檢測。但是隨著時代的不斷發(fā)展，近幾年我國科學發(fā)展速度越來越快，人們開始選擇利用化學發(fā)光反應法來檢測酶的活性。從標記免疫測定方式進行分析，能發(fā)現(xiàn)在選擇化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法即CLEIA，該方法本身屬于酶免疫的測定范疇，在檢測的工程中，其限低至10-17 mol／L，并且靈敏度較高，優(yōu)于傳統(tǒng)的放射免疫分析法。化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析相比，使用CLEIA法進行化學發(fā)光檢測酶活性其并不是通過熒光法或催化光度法測定，能提高檢測的整體效果和質量。除此之外，在檢測的過程中，某些特殊的金屬配合物可催化魯米諾進行化學發(fā)光反應。外國學者Muhammad等人曾利用Co（Ⅱ）和Fe（Ⅱ）的配合物代替酶作為抗原（或者是抗體）的標記物，以此實現(xiàn)化學發(fā)光免疫分析，最終獲得了成功。

2.1.4 化學發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展趨勢

近幾年，我國的社會發(fā)展速度越來越快，其中化學發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展速度同樣加快，由于這種檢測方式本身具有極強的優(yōu)勢。為此，在食品安全等各個不同的領域取得了廣泛的應用優(yōu)勢，但是這種方法在應用過程中并不是完全沒有缺點的，其中包括了以下幾點：第一，選擇該方式時，所使用的儀器體積較大；第二，在使用的過程中，樣品本身的基質對方法的應用效果干擾大；第三，測定的小分子物質精密度較低。為了進一步發(fā)展該技術，需要明確其后續(xù)的研究方式，其中包括了以下幾點：第一，改變儀器的大小，盡可能讓儀器向著微型便捷化發(fā)展；第二，在樣品處理之前，需要提高處理技術，使得處理技術達到更加高效，可以直接降低基質的干擾，增強該方法使用過程中的穩(wěn)定性；第三，不斷提高檢測過程中的整體效率，促進CLIA技術向著多組分檢測方向進行發(fā)展。

2.2 熒光免疫分析

2.2.1 熒光免疫分析技術的原理

熒光免疫分析是當前進行農藥殘留檢測過程中常見的檢測方法之一，這是由于熒光具有敏感可測性，能夠與抗原、抗體進行免疫反應，并且能夠實現(xiàn)高特異性有機結合，在抗體上標記熒光素作為跟蹤器來標記抗體、抗原以及抗分子本身具有極強的合成性，能夠提高檢測的整體質量。當抗體抗原或抗反應結合物被熒光底物進行照射時，無論是藍光或是紫光，照射底物都會存在吸收光照，進而轉化成為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)是一種不穩(wěn)定的狀態(tài)，其又會重回基態(tài)，而利用電磁輻射所釋放出的一系列被吸收的光能會在這一階段發(fā)出熒光信號，進而根據熒光的強度檢測出農藥的濃度曲線，被推斷出該待測樣品中所含有的農藥殘留量。

2.2.2 常見的熒光標記物類型

在使用熒光免疫分析技術時，需要了解到常見的熒光標記物類型有哪些，其中包括了以下幾種：第一，香豆素類標記物。這一種標記物在使用的過程中，原理是利用底物標記的熒光酶聯(lián)合免疫反應。在當前這一標記物使用得十分廣泛，而其中最為典型的香豆素類標記物為傘形酮。第二，熒光素標記物。熒光素標記物在使用的過程中，其優(yōu)勢在于本身具有非常高的熒光量子產率，以及在進行反應過程中摩爾吸光系數(shù)較高，屬于常見的熒光標記物，但是這一種標記物在使用的過程中存在著一個明顯的缺點，就是熒光素的熒光發(fā)射光譜會直接與膽紅素重疊，如果該檢測物品中存在大量的膽紅素，會對免疫反應產生極為嚴重的干擾。

2.2.3 均相熒光免疫分析

均相熒光免疫分析是指在抗體、抗原反應結束之后，對已經結合和沒有結合的標記物，并不需要進行分離，可以直接進行測量，例如通過熒光的吸收，激發(fā)，淬滅等特性獲得實驗結果。當前均相熒光免疫分析技術使用的頻率較高，而其中典型的分析方法如下：第一，利用熒光猝滅免疫分析，其中熒光素標記的抗原可以用作跟蹤試劑，其中特異性抗體和被分析物與跟蹤試劑結合后，并不會對跟蹤器的熒光帶來負面影響。在免疫反應結束之后加入熒光素抗體能夠在第一時間內將游離太與試劑進行結合，在結合后則會實現(xiàn)熒光淬滅空間。但是由于空間阻礙會導致抗體結合過程中的跟蹤劑無法完全結合熒光素抗體。為此，在使用這種方法時，熒光會隨樣品濃度增加而減弱，如果不考慮熒光猝滅的效率，在使用這一種方法時，其熒光信號會受到實際樣品中固有的熒光干擾，整個過程中樣品的檢測和校驗顯得尤為重要。第二，熒光激發(fā)共振能量的免疫分析。

2.2.4 熒光免疫分析技術的發(fā)展前景

近幾年熒光免疫分析技術發(fā)展速度迅速，其有效地彌補了傳統(tǒng)免疫分析法中存在的靈敏度較差或是在定量時相對困難等一系列問題，但是熒光免疫分析技術在使用過程中也存在著一定的不足。例如，部分免疫過程其標記材料的信號強度和穩(wěn)定性等有待改善。為此，為了進一步地提高熒光免疫分析技術的使用質量，需要做到以下幾點：第一，不斷地創(chuàng)新，并且發(fā)現(xiàn)更多新型的、成本相對較低的標記材料。第二，在拿到樣品后，需要對樣品進行前處理，提高藥品前處理技術，并且降低干擾機制，提高運用過程中的準確性。第三，提高檢測時的整體效率，能夠促進熒光免疫分析技術，并且實現(xiàn)多組分的檢測發(fā)展。第四，對熒光檢測分析儀器進行改善，實現(xiàn)智能化發(fā)展，進一步提高檢測過程以及檢測質量，最終實現(xiàn)檢測結果讀取的智能化。

3.免疫分析技術在農藥殘留快速檢測中的研究展望

3.1 研究中存在的缺陷

在近幾年的發(fā)展過程中，針對農藥殘留快速檢測這一工作內容，免疫分析技術已經成為極為重要的手段之一。但是免疫分析技術無論是在開發(fā)或是應用過程中都受到了一定的限制，這是由于在使用免疫分析技術時，其開發(fā)周期相對較長，并不是所有的農藥分子都可以在當前選擇免疫分析技術對其進行應用，部分沒有特征結構的農藥分子無法根據其農藥狀態(tài)設計半抗原，并且由于抗體本身存在的特異性，往往會出現(xiàn)假陽性的分析結果，直接誤導檢測人員，導致檢測質量無法得到提升這一現(xiàn)象屢見不鮮。

3.2 研究方向

針對免疫分析存在的一系列缺點和不足，需要對免疫分析的未來發(fā)展方向進行探討，其中包括了以下幾點：第一，利用基因重組或者是基因突變的方法，能夠有效地實現(xiàn)抗體改造，并且更好地對其載體進行溝通和建設，采用DNA免疫、細胞免疫等手段，能夠制備出更多具有極強親和力的抗體，逐步增加了免疫分析技術的整體質量，同時也能夠縮短在整個免疫過程中所需要消耗的時間。第二，在多殘留分析方面。有很多學者提出有部分小分子物質在進行免疫分析過程中，其存在交叉反應。為此，需要利用其反應過程中的分析物，以其代謝物的多殘留進行分析，提高分析的整體效果，有效地解決免疫分析中多殘留或者是由于反應物相同而導致的分析錯誤這一問題。利用蛋白芯片技術，但是蛋白芯片技術在我國食品分析中應用的時間相對較晚，近幾年才漸漸地展現(xiàn)出其應用價值，具有極為良好的分析前景。

4.結語

綜上所述，免疫分析技術能夠幫助我國進一步地進行農藥檢測，同時提高農藥檢測的整體質量，為我國經濟發(fā)展、社會發(fā)展帶來了極為正面的影響，