概率在分子遺傳學教學中的應用

張瀟瀟，甘 滔，王宇傳，劉秋云

（1.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275；2.昆明醫科大學生物醫學工程研究院/云南省干細胞和再生醫學重點實驗室，云南 昆明 650500；3.贛南醫學院基礎醫學院，江西 贛州 341000；4.華北理工大學基礎醫學院河北省慢性疾病基礎醫學重點實驗室，河北 唐山 063210）

分子遺傳學是在遺傳學基礎上發展起來的一門學科，主要研究基因的結構與功能、基因表達的調控、表觀基因組學調控等等。在以前發表的文章里，我們闡述了分子遺傳學的教學大綱，以及二項式分布與珀松分布在分子遺傳學課程里的具體運用[1]。然而，另有一些該課程的內容涉及概率的運用。這些計算方法的學習有利于學生更好地掌握課程的精髓，同時也有助于他們將來的學習和工作。

1 組織學生學習概率的實例

1.1 實例一：概率在RFLP分子標記上的應用

最早的分子標記是ABO血型。在18、19世紀，歐洲人認為輸血可以預防疾病、有益于健康。但他們觀察到輸血后部分人死亡，由此促使了ABO血型和更多其他血型的發現。真正的第一代分子標記是RFLP，由美籍華人簡悅威和一位西方科學家同時發現。他們通過限制性內切酶酶切DNA、電泳、Southern雜交，發現鐮刀細胞貧血病的致病基因產生了兩個條帶，而野生型只有一個條帶。部分限制性內切酶的識別序列為回文對稱。RFLP的建立由普林斯頓大學的David Botstein教授在20世紀70年代完成。

我們可以從概率的視角研究DNA，比如堿基配對概率是1/4，而錯配概率是3/4。如可選嘌呤堿基概率是2/4，可選嘧啶堿基也是2/4。對于EcoR I限制酶來說，其識別序列與切割序列均為GAATTC，所以概率是(1/4)6[2]。

1.2 實例二：概率在AFLP分子標記上的應用

AFLP是Amplified Fragment Length Polymorphism的簡稱，在植物研究上使用的較為廣泛[3]。一般情況下采用一個6堿基酶和一個4堿基酶共同切割，加上接頭，再進行PCR擴增。由于4堿基酶酶切位點極多，特異性主要由6堿基酶的特異性所決定。綜上所述，平均4096個堿基有一個6堿基酶酶切位點，這導致基因組AFLP擴增產生極多的片段。為了減少片段數量，需要在兩個引物的3’端分別加上2個和3個堿基，這樣理論上減少擴增片斷數量至原來可能數量的(1/4)2X(1/4)3。

1.3 實例三：概率在SNP分子標記上的應用

SNP是單核苷酸多態性[4]，在基因組上一般是雙等位的，作為分子標記區分度還不夠。為了更高精度的研究遺傳連鎖，我們可以考慮使用多對SNP，比如A/a,B/b,C/c三對SNP。這樣共有2X2X2=8種組合方式。將家系的基因型分成了8組。與遺傳疾病的連鎖關系的分析從而更為精確，特別是在關聯分析上很有價值。

1.4 實例四：概率在遺傳密碼擴增上的應用

科學家提出了引入更多的堿基對來擴增遺傳密碼數量[5]，一組科學家通過疏水配對引入了一對堿基，將遺傳字母增加到6個。那么這樣的DNA的4堿基、6堿基、8堿基回文對稱的限制性內切酶的識別頻率怎么計算呢？那就是(1/6)4、(1/6)6、(1/6)8。

另一組科學家將遺傳密碼的堿基用氫鍵配對擴增到8個，這樣的DNA的4堿基、6堿基、8堿基限制性內切酶的識別頻率就是(1/8)4、(1/8)6、(1/8)8。如此類推，遺傳密碼的增加將使蛋白質的多樣性得到極大的擴展。

1.5 實例五：概率在差異顯示上的應用

差異顯示（Differential Display）可以展示一對DNA樣品的mRNA條帶的差異。比如抗旱誘導的樣品與非抗旱誘導的樣品的比較，癌癥組織與癌癥組織旁邊正常組織的比較。這個技術用隨機引物與Oligo-dT引物配對進行PCR擴增，而Oligo-dT引物不能錨定于cDNA，故不能形成固定大小的片段。為了錨定引物，可在Oligo-dT引物的3’端加入2個堿基(A/G/C)(A/G/C/T)。這樣Oligo-dT錨定引物就共有3X4=12組。但是，另一端的隨機引物數為20組左右，通過配對產生了20X12=240個PCR組合，工作量太大。為了減少工作量，在Oligo-dT引物的3’端加入1個堿基(A/G/C)。這樣Oligo-dT錨定引物就共有3組。PCR組合減少為20X3=60個，工作量大大減少。

1.6 實例六：概率在古尸上的病毒基因組的恢復研究上的應用

墳墓里的古尸有些攜帶了古代流行病病毒等致病源。出于研究的需要，有時要恢復這些病毒基因組的完整序列。而尸體上的病毒DNA或RNA長度一般只有幾十個堿基。長的引物和較高的退火溫度無法PCR擴增或逆轉錄/PCR擴增，那么需要使用6堿基寡聚核酸（oligo）N6，其配對概率為（1/4）6。N6具有所有的6堿基組合，使用這個技術科研人員恢復了1918年西班牙流感H1N1的基因組。

1.7 實例七：概率在簡并DNA與定向進化研究上的應用

有時候需要對一個氨基酸位點進行所有氨基酸的替換，可以設計中間含NNN的引物，進行同源重組和雙交換。為了減少終止密碼子，可使用含NNK的Oligo，K代表T/G，這樣只有4X4X2=32個密碼子，終止密碼子只有一個，其他氨基酸的密碼子數量也得到了均一化。如果要對兩個氨基酸同時替換，可使用中間含NNKNNK的Oligo。

1.8 實例八：概率在分子標記輔助育種研究上的應用

在利用分子標記進行作物輔助育種研究時，一般使用單分子標記。方差是研究遺傳性狀的重要方法。有時，盡管兩組樣品平均值類似，但變異的幅度不一樣，產生的方差大小不一樣。單分子標記與產量性狀等存在一定重組，因此分析具有誤差。基于這一考量，MIT的EricLander提出用區間作圖法進行植物基因定位和克隆。原理是用兩個分子標記來定位某個決定性狀的基因。假設有兩對等位基因A/a和B/b，如果A和B之間存在一個高產基因Y,a和b之間存在一個低產基因y，A和B的重組距離為0.2,那么a和b之間存在Y的概率為x(0.2-x)，即通過一個雙交換a和b之間也可以得到一個高產等位基因Y。A和B之間存在一個高產基因Y的概率變為0.2-x(0.2-x)。通過類似這樣的加權處理，并結合線性回歸和最大似然法，Eric Lander開發出了廣泛使用的植物遺傳研究技術，加速了植物育種革命。

2 展望

綜上所述，通過運用概率進行分子遺傳學教學，將使學生對本學科有更深入的理解，學習時能夠結合一定的概率或其他數學知識，并加以運用。為本科生和研究生創新能力和跨學科思維能力的培養提供一條可行途徑。