不同提取方法與研磨方式對玉米種子DNA提取效果的影響

摘 "要：以玉米自交系Z17、Z24、Z29為材料，采用改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法和試劑盒法，比較不同提取方法和研磨方式對玉米種子基因組DNA的提取效果。通過超微量分光光度計檢測、瓊脂糖凝膠電泳和聚合酶鏈式反應（PCR） 擴增，對提取的基因組DNA進行分析。結果表明，與改良CTAB法相比，試劑盒法獲得的DNA濃度適宜，純度高，簡單快速，效果穩定。優化試劑盒法，從玉米干種子中直接提取DNA質量更高。

關鍵詞：玉米；種子；基因組DNA；研磨；影響

中圖分類號：S-3 " " "文獻標志碼：A " " " " "文章編號：2096-9902（2023）01-0032-04

Abstract： Using corn inbred lines Z17， Z24 and Z29 as materials， the effects of different extraction methods and grinding methods on genomic DNA extraction from corn seeds were compared by improved CTAB method and kit method. The extracted genomic DNA was analyzed by ultramicro spectrophotometer， agarose gel electrophoresis and PCR amplification. The results show that compared with the improved CTAB method， the DNA obtained by the kit method has the advantages of suitable concentration， high purity， simplicity， rapidity and stable effect. By further optimizing the kit method， the DNA directly extracted from dried corn seeds has a higher quality.

Keywords： corn; seed; genomic DNA; grinding; influence

基因組ＤＮＡ的提取和純化是植物分子生物學和遺傳育種學的基礎及關鍵環節。DNA 提取的質量對后續的分子育種學研究有著重要影響。在分子標記輔助育種中，隨著測序技術的快速發展及廣泛應用，人們經常需要提取高質量的植物DNA，用于酶切、構建基因文庫、測序、品種純度和真實性鑒定等。根據植物的研究對象、研究目的和研究成本等的不同，提取基因組DNA所應用的方法也不同[1]。1987年Doyle最先應用CTAB法[2]進行植物DNA的提取，此方法多用于禾本科植物基因組DNA的提取。目前常用的植物DNA提取有PVP法、SDS法、高鹽提取法等。

植物DNA的提取質量受材料的選擇、提取方法、操作過程等因素的影響。玉米材料多為新鮮或冷凍的植物組織。新鮮玉米葉片或玉米黃化苗的細胞正處于分裂期，代謝產物少，含有較多完整的DNA。然而在育種過程中，需要長距離取樣或南繁異地取樣，影響樣品的質量，易使DNA降解而質量下降。玉米分子育種研究的樣品材料多數為干種子，其中含有大量的多糖、淀粉、蛋白質等物質[3]，如何快速有效地去除這些物質，從玉米干種子中提取到高質量的基因組DNA是分子育種研究的關鍵技術。魏琦超等[4]利用鄭單958玉米種子，改良了CTAB法直接用于干種子DNA的快速提取。董永軍等[5]針對干種子淀粉高的特點，采用全自動研磨儀進行機械粉碎，提取的DNA可以滿足簡單序列重復標記（SSR）和單核苷酸多態性（SNP）等分子試驗的要求。李藝等[6]提出了一種從玉米種子胚中快速提取基因組DNA的新方法，將干種子70 ℃水浴后取胚，用改良CTAB法提取DNA，提取過程快速，可減少DNA的降解。劉可心等[7]采用NaOH浸泡結合CTAB法提取玉米種皮DNA，然后進行DNA指紋分析，顯示種皮 DNA 基因型能夠代表雜交種母本DNA指紋。魏國燕等[8]采用改進的CTAB提取液，以高溫和常溫2種方法提取玉米胚乳基因組DNA，結果表明高溫法提取的DNA均未降解，更適宜用作玉米胚乳DNA提取。前人對玉米種子DNA提取方法的研究多為對CTAB方法的改良，由于CTAB方法含有氯仿、β-巰基乙醇、異戊醇和異丙醇等毒性較強的易揮發物質，對實驗員身體有很大傷害。本試驗采用不同的種子處理和提取方法，通過比較提取到的玉米基因組DNA質量，旨在集成一種高質、簡單、快速且環保的玉米種子基因組DNA提取方法，滿足下游分子生物學試驗的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗中所用的材料均為公司自育玉米品種Z17、Z24、Z29，采自公司深圳大鵬基地。

1.2 試劑及主要儀器

提取全基因DNA所用試劑為改良的CTAB提取液、三氯甲烷、異戊醇和乙醇。Omega Bio-Tek公司生產的SP植物DNA提取試劑盒（貨號：D5511）。

主要儀器有冷凍研磨儀（上海凈信JXFSTPRP-CL）、凝膠成像系統（UVP BioDoc-It220）、電泳儀（DYY-6C）、超微量分光光度計（B-500）等。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

選Z17、Z24、Z29 3個玉米品種的曬干種子，用75%的酒精沖洗、擦拭干凈后，用A1、A2、A3 3種處理方式進行研磨（表1），通過改良CTAB法和試劑盒法進行DNA提取，共18組處理。如方式A1為加入研磨鋼珠，用JXFSTPRP-CL冷凍研磨儀磨成勻漿后提取DNA。方式A2用鑷子將玉米種子的胚剝離開來，在研缽中加入液氮，手動研磨后提取DNA。方式A3將干種子浸泡24 h后，再進行液氮手動研磨、提取DNA。18組處理所提取的DNA編號見表1。

1.3.2 DNA濃度和純度的測定

利用超微量分光光度計（B-500）測定不同編號所提玉米基因組DNA在OD260、OD280的吸收值和OD260/280比值， 當1.8≤OD260/280lt;2.0時，表明DNA純度好，DNA中蛋白質、RNA及酚類等雜質含量合乎實驗要求。

1.3.3 DNA質量的檢測

將不同編號的玉米基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，于70 V穩定電壓下電泳20 min，電泳結果在凝膠成像系統（UVP BioDoc-It220）中觀察成像。

所得DNA用于玉米基因LOC100272738的PCR反應模板，用本實驗室優化的反應體系進行PCR檢測。擴增反應總體積為10 μL，1 μL模板DNA，5 μL 2×EasyTaq " PCR SuperMix（含EasyTaq " DNA Polymerase、dNTPs）、正向和反向引物各0.5 μL、3 μL ddH2O。擴增程序為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min；32個循環；72 ℃延伸10 min。擴增的PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，Trans 1K Plus DNA Ladder作為對照，在凝膠成像系統上觀察電泳結果。

2 結果與分析

2.1 不同處理組合的DNA濃度與純度

利用超微量分光光度計檢測18組處理終產物，結果表明，不同處理得到的玉米種子基因組DNA濃度和純度不同。由表2可知，18組處理所獲得的總DNA的濃度在100.52～881.13 ng/uL，OD260/280值在1.82～2.04，4組處理的DNA純度稍大于2.0，DNA純度達到要求。同一種種子處理條件下，改良CTAB法提取的DNA濃度高于試劑盒提取的量。其中，以A1B1-2所得的濃度最高，為881.13 ng/uL，即干種子機械研磨后用改良CTAB法進行提取，獲得的DNA濃度最高。而相同的種子處理方式，用試劑盒提取獲得的DNA濃度最低（A1B2-1，100.52 ng/μL）。對比3種種子處理方式DNA提取量，種子泡水24 h后進行研磨，能獲得較高的DNA濃度。總體來看，試劑盒提取法獲得的玉米種子基因組DNA純度OD260/280值均在1.91以下，雜質少，這得益于試劑盒所用的硅膠柱純化方式。

2.2 不同處理方法的DNA質量

不同研磨方式2種提取方法獲得的DNA瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1和圖2所示。18組處理提取得到的基因組DNA都發生了不同程度的降解，這和報道一致，自然條件下干燥后提取的玉米材料DNA降解率較高[1]。不同處理方式對DNA質量影響差異顯著，不同的玉米品種提取的DNA質量無明顯差異。

由圖2可知，試劑盒法提取的玉米種子基因組DNA條帶較改良CTAB法更清晰明亮，在10 kb以上的位置，可看到主條帶。7～9孔為種子浸泡后研磨，DNA降解較嚴重，改良CTAB法亦出現同樣結果（圖1，4～6孔）。改良CTAB法的9個樣品的DNA濃度高，但降解嚴重，看不到10 kb以上的主條帶，電泳條帶微弱且彌散現象嚴重。

2.3 不同處理組合的DNA擴增結果

本實驗進一步優化試劑盒法，在研磨時加入裂解液，使樣品充分懸浮，減少DNA的降解，提高DNA產量。同時，利用公司實驗室優化的PCR擴增體系進行擴增。以9組處理后提取的玉米種子基因組DNA為模板，對玉米基因LOC100272738進行PCR擴增，擴增預期片段大小為126 bp。PCR擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，3個玉米品種的基因LOC100272738均得到擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致。圖3中Z29的擴增片段條帶較模糊（第6、9孔），用試劑盒法對Z29種子的提取效果較其他2個玉米品種Z17、Z24差。

3 結論

DNA提取質量的好壞影響到下游分子實驗，關于育種種子的研究，大部分報道都和CTAB法的改良相關。玉米種子，研磨過程耗時長，容易導致DNA降解。由于玉米種皮雜質多，在進行玉米種子DNA提取的時候，大多數研究人員選取了提取質量穩定、去除多糖等雜質效果較好的CTAB方法進行改良，但該方法步驟繁瑣，耗時長，且所用試劑均為易揮發強毒性物質。在DNA提取過程應針對樣品本身的情況，選擇合理的方法進行優化配置。

本實驗通過比較18組處理的DNA濃度、純度、質量和完整性，試劑盒法優于改良CTAB法。改良CTAB法提取得到的DNA濃度遠大于試劑盒法，但結果顯示（圖1），電泳圖譜中改良CTAB法的DNA條帶較暗，可能玉米種子DNA提取產物中的雜質較多，影響了微量分光光度計的讀數，DNA濃度讀數偏大。

玉米胚剝開后用液氮手動研磨提取得到的DNA濃度大于干種子機械研磨提取，2種處理方式得到的DNA質量相差不大。有研究表明，采用改進法[9]，無論從胚和胚乳中提取的DNA都可以滿足隨機擴增多態性DNA（RAPD）的要求[10]。玉米種子用水浸泡24 h后進行研磨處理，DNA降解嚴重，推測可能種子吸水膨脹DNA受到破壞，干燥種子中DNA保存得更完整。

本實驗中使用的試劑盒法，通過優化，在進行種子研磨的時候，加入裂解液和RNA酶，實現最大速度渦旋混勻。同時，縮短裂解時間，減少反復溶解DNA的步驟，降低DNA的降解。試劑盒采用勻漿柱過濾方式去除雜質，減少后續再純化造成DNA斷裂。整個提取過程常溫操作，對實驗條件要求低，獲得的DNA濃度和純度均滿足分子生物學的要求。同時，提取過程無有害的酚氯仿等有機物，減少環境污染。因此，通過18組處理的對比，利用試劑盒法可以實現玉米干種子高質量DNA的快速提取。在以后的品種鑒定實驗中，可以嘗試用玉米胚乳，結合試劑盒法進行基因組DNA的提取，鑒定出的目標品種留下的胚可以繼續發芽生長。

參考文獻：

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