外源油菜素內酯引發對劣變燕麥種子抗氧化特性的影響

摘要：為探討外源油菜素內酯引發對劣變種子抗氧化能力的影響，試驗采用燕麥（Avena sativa）種子為材料，人工老化后經不同濃度（0，0.01，0.10，0.50，1.00，10.00 μmol·L^-1）的油菜素內酯（Brassinosteroids，BR）溶液引發0（CK），1，6，12，18和24 h，分析了其發芽率、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性及丙二醛（Maloddialdehyde，MDA）含量的變化規律。結果表明：低濃度（0.01～0.50 μmol·L^-1）的BR可提高燕麥種子的發芽率，增加其SOD，CAT，APX和GR活性，降低其MDA含量；而BR濃度為10.00 μmol·L^-1時（除引發18 h外），其發芽率、CAT、APX和GR活性均低于CK，增加MDA含量。濃度為0.01 μmol·L^-1的油菜素內酯引發24 h可能是緩解燕麥種子老化的最佳處理。

關鍵詞：油菜素內酯；燕麥；種子老化；種子引發；抗氧化性能

中圖分類號：S152.6文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）05-1461-08

Effect of Exogenous Brassinosteroids Priming on Antioxidant

Characteristics of Deteriorated Oat Seeds

WANG Bo， XIA Fang-shan DONG Qiu-li， CEN Hui-fang， LI Yin-lin， ZHANG Jie-min

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：In order to explore the effect of exogenous brassinosteroid priming on the antioxidant capacity of deteriorated seeds，Oat （Avena sativa） seeds were used as materials，and tested them with different concentrations （0，0.01，0.10，0.50，1.00，10.00 μmol·L^-1） brassinosteroid solution initiated for 0 （CK），1，6，12，18 and 24 h durations. The changes of germination rate，superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT），ascorbate peroxidase （APX），glutathione reductase （GR） and malondialdehyde （MDA） content were analyzed. The results showed that low concentration （0.01～0.50 μmol·L^-1） of BR improved the germination rate of oat seeds，and increase the activities of SOD，CAT，APX and GR，and reduce the content of MDA in the oat seeds. When the concentration of BR reached 10.00 μmol·L^-1 （except for 18 h initiation），the germination rate，CAT，APX and GR activities were lower than those of the seeds in CK，and the MDA content was higher. Priming with 0.01 μmol·L^-1 brassinolide for 24 h may be the best treatment to alleviate the aging of oat seeds.

Key words：Brassinosteroids;Oats;Seed aging;Seed priming;Oxidation resistance

國無農不穩，農以種為先，種子是農業高質量發展的“芯片”，種業作為我國的基礎性和戰略性產業，直接關系到國家的生態安全、社會穩定和經濟繁榮［1-2］。然而，種子在儲藏過程中總會不同程度地發生老化現象，其內部會發生細胞膜損傷、蛋白質變性［3］、DNA損傷和突變［4］、核酸合成系統破壞［5］等一系列有害變化，導致其萌發及幼苗生長能力下降，從而造成植物產量及品質的大幅降低，給農牧業生產帶來巨大的經濟損失［6］。種子引發不僅能提高植物的產量和品質，還能增強植物在逆境條件下的抗氧化能力，抑制其脂質過氧化作用的發生，從而提高其抗逆性［7］。因此，種子引發成為當今種子科學領域的一個研究熱點。

采用外源物質引發是調控植物抗逆性的高效易行方法之一，多種外源激素已被證實對于各種非生物脅迫下作物種子的萌發及其幼苗生長等方面具有促進作用［8］。油菜素內酯（Brassinosteroids，BR）又稱蕓苔素，是一類存在于油菜花粉中的新型植物激素，對植物生長發育存在至關重要的影響［9-10］。外源施用BR能夠有效提高抗氧化能力是緩解植物對重金屬脅迫［11-13］、低溫脅迫［10，14］、水分脅迫［15-16］、干旱脅迫［17-18］等非生物脅迫的有效適應機制。非生物脅迫破壞細胞內穩態，導致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量增加，過量ROS的積累導致碳水化合物、蛋白質、DNA、脂質和其他大分子的氧化損傷，并促進細胞凋亡和衰老［19］。研究發現，施用BR可以增加草地早熟禾（Poa pratensis）［11］、玉米（Zea mays）［13］、水稻（Oryza sativa）［14］、煙草（Nicotiana tabacum）［17］、辣椒（Capsicum annuum）［20］等植物的抗氧化能力，增加滲透物質水平，維持內源激素平衡，穩定離子和水分平衡，改善氣體交換屬性和光合作用，促進其生長發育［19］。Kaya等［20］研究發現，施用油菜素內酯通過增加鎘脅迫下辣椒的脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）和硝酸還原酶活性來降低抗氧化性能。目前，關于油菜素內酯對植物生長的研究多集中在非生物脅迫領域，尚未有關于油菜素內酯引發如何影響劣變種子的研究報道。因此，本試驗旨在探究油菜素內酯引發對劣變種子抗氧化性能的影響。

燕麥（Avena sativa）是禾本科燕麥屬一年生草本植物，具有耐瘠薄，耐鹽堿，抗旱耐寒等優點［21］，是適宜種植在高寒地區和干旱半干旱地區的優良飼草和作物。此外，燕麥種子含有不飽和脂肪酸達到80%以上，由于脂肪衍生物容易酸敗或劣變，燕麥籽實的高脂肪含量會導致其種子更容易發生劣變，從而限制了燕麥籽實在食物及種子方面的廣泛應用［6，22］。因此，研究燕麥種子活力對種質資源的利用與保存具有重要意義。研究表明，貯藏年限和種子含水量的不同也會對劣變燕麥種子活力產生不同的影響［22-23］，通過種子引發的方式則可以提高劣變燕麥種子的發芽率及抗氧化性能，緩解劣變對其產生的損傷［24-26］，但未有相關學者研究外源激素對劣變燕麥種子的影響。因此，本試驗以劣變燕麥種子為材料，分析不同濃度油菜素內酯溶液引發不同時間后其抗氧化酶活性及脂質過氧化的變化規律，以期揭示劣變燕麥種子響應油菜素內酯引發的抗氧化性能差異，并篩選出提高劣變燕麥種子活力及抗氧化性能的最佳濃度及引發時間，為劣變燕麥種子的科學利用及活力修復研究提供理論基礎，為貯藏種子的科學利用提供理論指導。

1材料與方法

1.1材料來源

供試材料為燕麥種子（品種為‘太陽神’），購買于北京正道農業股份有限公司，購買時間為2021年5月，種子獲取后均密封保存于種子庫（-20℃）內至2022年7月試驗進行，初始含水量為9.56%，初始發芽率為99%。

1.2種子引發處理

去除燕麥種子外殼后，參考劉備等［27］的方法將燕麥種子含水量調整至10%左右，并置于鋁箔袋（18.50 cm×14.50 cm）中密封，最后放于45℃恒溫水浴箱中進行控制劣變處理，至種子發芽率為80%左右時將其取出后置于不同濃度（0，0.01，0.10，0.50，1.00，10.00 μmol·L^-1）的油菜素內酯溶液中引發0（CK），1，6，12，18和24 h，然后快速用蒸餾水沖洗3遍，并迅速用干濾紙吸完其種皮表面水分后于20℃黑暗條件自然風干至含水量為引發前含水量（鮮重基礎），置于4℃冰箱中備用。

1.3發芽試驗

根據國際種子檢驗協會的種子檢驗規程（2019）［28］對油菜素內酯引發后的燕麥種子進行標準發芽試驗測定其發芽率（Germination percentage，Gp），每個處理重復4次，具體操作步驟參照文獻［25］。

1.4生理指標測定

粗酶液參照Kibiza等［29］的方法提取，準確稱取0.1 g種子于室溫條件下用蒸餾水吸脹4 h后冰浴研磨，上清液于4℃條件保存備用，每個指標的測定均取用3 mL粗酶液。SOD活性測定參照Rao和Sresty［30］的方法，CAT活性測定參照Aebi［31］的方法，APX活性測定參照Nakano和Asada［32］的方法，GR活性測定參照Madamanchi和Alscher［33］的方法，MDA含量測定參照Bailly等［34］的方法，可溶性蛋白含量采用南京建成科技有限公司所生產的試劑盒測定。

1.5數據統計與分析

以Excel 2010軟件進行數據整理，并用SPSS 22.0軟件對各指標數據進行單因素方差分析，多重比較（Plt;0.05）則采用Duncans法進行，最終以平均值±標準誤方式表示結果。

2結果與分析

2.1油菜素內酯引發對劣變燕麥種子發芽率的影響

由表1可知，BR濃度為0 μmol·L^-1時，燕麥種子發芽率隨著引發時間的增加呈先降后升的趨勢，在引發時間為24 h時達到最高；BR濃度為0.01 μmol·L^-1時，燕麥種子發芽率隨著引發時間的增加呈上升趨勢（除引發18 h外），在引發24 h時顯著（Plt;0.05）高于其他時間；BR濃度為0.10～10.00 μmol·L^-1時，燕麥種子發芽率隨引發時間的增加呈先升后降的趨勢。相同引發時間下，不同BR濃度的燕麥種子發芽率存在很大差異。引發1 h時，燕麥種子的發芽率隨著BR濃度的增加呈下降趨勢；引發6～12 h時，燕麥種子發芽率隨BR濃度增加呈先升后降的趨勢；引發18 h時，燕麥種子發芽率隨BR濃度的增加呈先升后降的趨勢（0.01 μmol·L-1外）；引發24 h時，燕麥種子發芽率隨濃度的增加呈先升后降的趨勢，在濃度為0.01 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他處理。濃度為0.01 μmol·L^-1引發24 h和濃度為0.10 μmol·L^-1時引發18 h，這二者是油菜素內酯引發的最適濃度與時間最優組合。

2.2油菜素內酯引發對劣變燕麥種子超氧化物歧化酶活性的影響

由表2可知，BR濃度為0 μmol·L^-1時，燕麥種子SOD活性隨著引發時間的增加呈先降后升的趨勢，在引發時間為24 h時顯著（Plt;0.05）高于其他引發時間；BR濃度為0.01 μmol·L^-1時，燕麥種子SOD活性隨著引發時間的增加呈上升趨勢（除引發18 h外），在引發24 h時顯著（Plt;0.05）高于其他時間；BR濃度為0.10～10.00 μmol·L^-1時，燕麥種子SOD活性隨引發時間的增加呈先升后降的趨勢。相同引發時間下，引發1 h時，燕麥種子的SOD活性隨著BR濃度的增加呈下降趨勢，在BR濃度為0 μmol·L^-1時達到最高；引發6～12 h時，燕麥種子SOD活性隨BR濃度增加呈先升后降的趨勢；引發18 h時，燕麥種子SOD活性隨BR濃度的增加呈先升后降的趨勢（0.01 μmol·L^-1除外），在0.10 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他濃度；引發24 h時，燕麥種子SOD活性隨濃度的增加呈先升后降的趨勢，在濃度為0.01 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他處理。

2.3油菜素內酯引發對劣變燕麥種子過氧化氫酶活性的影響

由表3可知，BR濃度為0 μmol·L^-1時，燕麥種子CAT活性隨著引發時間的增加呈先降后升的趨勢，在引發時間為24 h時顯著（Plt;0.05）高于其他引發時間；BR濃度為0.01 μmol·L^-1時，燕麥種子CAT活性隨著引發時間的增加呈上升趨勢（除引發18 h外），在引發24 h時顯著（Plt;0.05）高于其他時間；BR濃度為0.10～10.00 μmol·L^-1時，燕麥種子CAT活性隨引發時間的增加呈先升后降的趨勢。相同引發時間下，引發1 h時，燕麥種子的CAT活性隨著BR濃度的增加呈下降趨勢，在BR濃度為0 μmol·L^-1時達到最高；引發6～12 h時，燕麥種子CAT活性隨BR濃度增加呈先升后降的趨勢；引發18 h時，燕麥種子CAT活性隨BR濃度的增加呈先升后降的趨勢（0.01 μmol·L^-1除外），在0.10 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他濃度；引發24 h時，燕麥種子CAT活性隨濃度的增加呈先升后降的趨勢，在濃度為0.01 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他處理。

2.4油菜素內酯引發對劣變燕麥種子抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

由表4可知，BR濃度為0 μmol·L^-1時，燕麥種子APX活性隨著引發時間的增加呈先降后升的趨勢，在引發時間為24 h時達到最高；BR濃度為0.01 μmol·L^-1時，燕麥種子APX活性隨著引發時間的增加呈上升趨勢（引發18 h除外），在引發24 h時顯著（Plt;0.05）高于其他時間；BR濃度為0.10～10.00 μmol·L^-1時，燕麥種子APX活性隨引發時間的增加呈先升后降的趨勢。相同引發時間下，引發1 h時，燕麥種子的APX活性隨著BR濃度的增加呈下降趨勢，在BR濃度為0 μmol·L^-1時達到最高；引發6 h時，燕麥種子APX活性在BR濃度為0.01～1.00 μmol·L^-1間無顯著差異，在濃度為1.00 μmol·L^-1時達到最高；引發12 h時，燕麥種子APX活性隨BR濃度的增加呈先升后降的趨勢；引發18 h時，燕麥種子APX的活性隨BR濃度的增加呈先升后降的趨勢（0.01 μmol·L^-1除外），在0.10 μmol·^L-1時顯著（Plt;0.05）高于其他濃度；引發24 h時，燕麥種子APX活性隨濃度的增加呈先升后降的趨勢，在濃度為0.01 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他處理。

2.5油菜素內酯引發對劣變燕麥種子谷胱甘肽還原酶活性的影響

由表5可知，BR濃度為0 μmol·L^-1時，燕麥種子GR活性隨著引發時間的增加呈先降后升的趨勢，在引發時間為24 h時達到最高；BR濃度為0.01 μmol·L^-1時，燕麥種子GR活性隨著引發時間的增加呈上升趨勢（除引發18 h外），在引發24 h時顯著（Plt;0.05）高于其他時間；BR濃度為0.05～10.00 μmol·L^-1時，燕麥種子GR活性隨引發時間的增加呈先升后降的趨勢。相同引發時間下，引發1 h時，燕麥種子的GR活性隨著BR濃度的增加呈下降趨勢，在0 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他處理；引發6～12 h時，燕麥種子GR活性隨BR濃度增加呈先升后降的趨勢，均在濃度為0.10 μmol·L^-1時達到最高；引發18 h時，燕麥種子GR活性隨BR濃度的增加呈先升后降的趨勢（0.01 μmol·L^-1除外），在0.1 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他濃度；引發24 h時，燕麥種子GR活性隨濃度的增加呈先升后降的趨勢，在濃度為0.01 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他處理。

2.6油菜素內酯引發對劣變燕麥種子丙二醛含量的影響由表6可知，BR濃度為0 μmol·L^-1時，燕麥種子MDA含量均顯著（Plt;0.05）低于CK；BR濃度為0.01 μmol·L^-1時，燕麥種子MDA含量隨著引發時間的增加呈降低趨勢（引發18 h除外），在引發0和18 h時顯著（Plt;0.05）高于其他時間；BR濃度為0.10～0.50 μmol·L^-1時，燕麥種子MDA含量隨引發時間的增加呈先降后升的趨勢，均在引發時間為0 h時達到最高；BR濃度為1.00～10.00 μmol·L^-1時，燕麥種子MDA含量均在引發啥時間為1 h時顯著（Plt;0.05）高于其他處理。相同引發時間下，引發1 h時，燕麥種子的MDA含量隨著BR濃度的增加呈上升趨勢，在BR濃度為10.00 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他處理；引發6～12 h時，其MDA含量隨BR濃度增加呈先降后升的趨勢，均在濃度為10.00 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他處理；引發18 h時，燕麥種子MDA含量在0.01 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他濃度；引發24 h時，燕麥種子MDA含量隨濃度的增加呈先降后升的趨勢，在濃度為10.00 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）高于其他處理，濃度為0.01 μmol·L^-1時顯著（Plt;0.05）低于其他處理。

3討論

種子萌發及幼苗建成是植物生命周期的關鍵時期，此時對外界環境因子反應最敏感［31］。而油菜素內酯引發可提高種子的活力水平及抗氧化能力［17］，范翠枝等［35］研究發現，10-9 mol·L^-1的2，4-表油菜素內酯浸種能夠顯著促進番茄種子萌發、種子胚根和下胚軸長度。應用0.01 μmol·L^-1的2，4-表油菜素內酯溶液對黑麥草（Lolium perenne）進行浸種處理，可以提高其發芽率，有效緩解NaCl脅迫對黑麥草種子活力的影響［36］。本研究發現，與CK相比，濃度為0.01 μmol·L^-1的BR引發24 h及0.10 μmol·L^-1的BR引發18 h后顯著（P＜0.05）提高了劣變燕麥種子的發芽率，這可能是因為種子萌發所需的能量和營養物質主要由淀粉酶水解淀粉和蛋白水解酶分解貯藏蛋白提供，BR處理能明顯增強α-淀粉酶的活性，但隨BR濃度的上升而下降［37］。低濃度的BR會促進劣變燕麥種子萌發，而高濃度抑制其萌發，這與外源BR調控下促進蕎麥（Fagopyrum esculentum）［8］、水稻［10］、黑麥草［36］植物種子萌發的研究結果一致，說明BR對劣變燕麥種子活力的修復作用也具有雙重效應。

抗氧化酶是植物細胞內調控ROS自由基平衡的主要清除劑，可緩解植物種子劣變過程中過量積累的ROS對其細胞膜的攻擊作用，減弱其細胞膜的脂質過氧化，進而降低植物種子的老化速率［38］。抗氧化酶SOD，CAT及抗壞血酸-谷胱甘肽循環能夠有效地清除過量積累的ROS，從而避免或減輕ROS對種子造成的損傷。不同濃度BR引發下，燕麥種子細胞內SOD，CAT，GR，APX的活性都表現出不同的趨勢，這說明適宜濃度的BR引發可以提高劣變燕麥種子的抗氧化能力。本研究發現，與CK相比，外源BR濃度為0.01～0.50 μmol·L^-1時，其SOD，CAT，APX，GR均保持較高活性，其MDA含量相對較低，此時劣變燕麥種子可以通過增強其抗氧化酶活性來清除劣變過程中生成的ROS，減輕其脂質過氧化程度。這與外源BR提高水稻［10］、煙草［17］、紫花苜蓿（Medicago sativa）［37］等植物抗氧化酶活性的研究結論相類似，這可能是外源施用BR處理通常可以調控相關抗氧化防御系統的活性，從而誘發燕麥種子細胞內防御體系建立及時的應答與清理機制，保持細胞內外離子平衡，降低MDA的產生，降低體內ROS含量，減少過氧化作用對膜質的損害［19，39］。當BR濃度為10 μmol·L^-1時，除引發18 h外，盡管引發6～12 h其SOD高于CK，但其CAT，APX，GR均已低于CK，種子細胞內MDA含量均顯著高于CK，這表明此時燕麥種子細胞內抗氧化酶活性已不足以消除其產生的ROS，從而導致其脂質過氧化程度損傷。BR濃度為0.01 μmol·L^-1引發24 h時，燕麥種子細胞內SOD，CAT，APX，GR活性均達到最高，其MDA含量相對最低，因此0.01 μmol·L^-1引發24 h可能為本試驗中的最佳處理。

4結論

外源油菜素內酯引發對劣變燕麥種子發芽率與抗氧化能力的影響與其濃度及引發時間有密切關系，其中，油菜素內酯濃度為0.01 μmol·L^-1引發24 h時為最佳處理。低濃度的油菜素內酯溶液能有效緩解燕麥種子的劣變現象，提高種子發芽率、提高抗氧化酶SOD，CAT，APX，GR活性，誘導降低MDA含量，緩解劣變對燕麥種子造成的傷害，高濃度則反之。

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（責任編輯 彭露茜）