大葉落地生根KdSRG1基因的克隆、表達分析及自激活檢測

摘要：為探究大葉落地生根（Kalanchoe daigremontiana）中衰老相關基因1（Senescence-related gene 1，SRG1）的功能，以野生型大葉落地生根為材料，克隆KdSRG1基因，對其進行生物信息學分析、亞細胞定位和基因表達分析。結果表明：KdSRG1基因開放閱讀框為219 bp，編碼72個氨基酸；KdSRG1蛋白是一個親水性的不穩(wěn)定酸性蛋白，定位于細胞核和細胞質，不含跨膜結構和信號肽，并且具有物種上的特異性；該基因在大葉落地生根的不定芽和葉中的相對表達量較高，說明其參與不定芽和葉的生長調控；通過分析其啟動子順式作用元件，推測KdSRG1基因參與植物分生組織表達和柵欄細胞分化過程，并且其表達可能受光信號、脫落酸（Abscisic acid，ABA）和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）調控，同時可能在植物逆境脅迫調控方面發(fā)揮作用；自激活檢測表明KdSRG1蛋白沒有自激活活性，可用于后續(xù)的酵母雙雜實驗。本研究為進一步研究KdSRG1基因的作用機制及功能奠定了基礎。

關鍵詞：大葉落地生根；KdSRG1基因；基因克隆；亞細胞定位；表達分析

中圖分類號：Q781文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）05-1349-10

Cloning，Expression Analysis and Self-activation Detection of KdSRG1

Gene from Kalanchoe daigremontiana

LUAN Ya-lin， PAN Jia-ni， WANG Meng-di， LI Yin-rui-zhi， ZENG Hui-ming

（School of Grassland Science， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China）

Abstract：In order to explore the functions of the senescence-related gene （SRG1） in Kalanchoe daigremontiana，the gene of KdSRG1 was cloned from the wild-type K daigremontiana，and then analyzed for its bioinformatics，subcellular localization，and gene expression analysis. The results showed that the open reading frame of KdSRG1 was 219 bp in length，encoding a peptide of 72 amino acids. The KdSRG1 protein is a hydrophilic unstable acidic protein，which was localized in the nucleus and the cell membrane，and had no transmembrane structures or signal peptides and species specific in property. The relative expression of KdSRG1 gene in K. daigremontiana was higher in its plantlets and leave than that in the roots and stems，which demonstrated that gene may be involved in the regulation of adventitious bud and leaf growth. By analyzing the cis-acting elements of KdSRG1 promoter，it was speculated that KdSRG1 gene would take a role in that plant meristem formation and palisade mesophyll cells differentiation，and the expression of this gene may be regulated by light signal，abscisic acid （ABA），and methyl jasmonate （MeJA）. Moreover，the KdSRG1 gene may play a role in that plant stress regulation. The self-activation detection showed that KdSRG1 protein had no self-activation activity and could be used to the subsequent yeast two-hybrid experiments. This study could be used for further research on the functional mechanisms of KdSRG1 gene.

Key words：Kalanchoe daigremontiana;KdSRG1 gene;Gene cloning;Subcellular localization;Expression analysis

作為廣泛存在于生物體中的氧化還原酶之一，α-酮戊二酸/Fe（II）依賴雙加氧酶（2-oxoglutarate/Fe（II）-dependent dioxygenase，2-ODD）具有重要的生物學作用。2-ODD超家族極其龐大，是植物體內的第二大酶家族，其通過催化氧化反應合成多種代謝物［1-2］。2-ODD的催化過程是以α-酮戊二酸（2-oxoglutarate，2OG）和O₂為共底物，Fe²⁺為輔因子來催化底物氧化，同時2OG脫羧形成CO₂和琥珀酸［3］。就底物和產物的選擇性而言，2-ODD是最具有生化活性的酶之一［4］。

在植物中，廣泛的生物學過程都有2-ODD的參與，包括DNA去甲基化、脯氨酸羥基化和植物激素生物合成等［1］。其中，植物激素的生物合成對于農作物來說具有重要意義，因此大部分相關研究集中在這一方面。研究發(fā)現，2-ODD參與植物中類黃酮、赤霉素和乙烯的合成途徑［6］。2-ODD超家族中，GAI4基因參與赤霉素的合成，并且在種子萌發(fā)過程中起重要作用［7］；MdCo31基因高表達會導致內源GA1減少，從而使植物出現矮化表型［8］；OsFLS基因同時具有黃酮醇合成酶和黃烷酮3-羥化酶的活性，可以催化黃烷酮和二氫黃酮醇的互相轉化，是一種雙功能的2-ODD酶［9］。此外，2-ODD在植物中的其他功能也得到充分研究，如在陸地棉（Gossypium hirsutum L.）和日本晴水稻（Oryza sativa L. ssp. japonica）中響應干旱脅迫［9-10］，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中影響植物防御機制［11］，在水稻（Oryza sativa L.）中影響卷葉性狀［12］。因此，2-ODD不僅在植物的生長發(fā)育方面發(fā)揮重要作用，而且其參與合成的次生代謝物具有極高的藥用價值［13］。

大葉落地生根（Kalanchoe daigremontiana）是景天科（Crassulaceae）伽藍菜屬（Kalanchoe）的一種多年生肉質草本植物，原產于非洲馬達加斯加，屬于營養(yǎng)體胎生植物類型［14］。在大葉落地生根中提取的天然化合物具有抗腫瘤、抗炎和殺蟲的作用［15-16］。大葉落地生根的不定芽在葉緣粗齒處呈對稱生長并在合適條件下形成完整植株，體現了典型的植物體細胞全能性，并且其不定芽的發(fā)育過程同時具有細胞胚胎發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑，是研究植物無性繁殖的理想模型［17］。此外，大葉落地生根也是景天酸代謝（Crassulacean acid metabolism，CAM）途徑的模式植物，并以此途徑進行光合作用［18］。衰老相關基因1（Senescence-related gene 1，SRG1）所編碼的蛋白具有2-ODD結構域，屬于2-ODD超家族。隨著現代分子生物學和生物信息學的發(fā)展，有關2-ODD的研究越來越廣泛和深入，但有關大葉落地生根KdSRG1基因的研究未見報道。本研究通過克隆大葉落地生根KdSRG1基因，對其進行生物信息學分析、自激活檢測、亞細胞定位和基因表達分析，初步探討了KdSRG1的功能，為深入研究該基因的作用機制及功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料

實驗材料為野生型大葉落地生根，種植于北京林業(yè)大學草坪研究所人工氣候箱中，基質為蛭石、草炭、珍珠巖，其體積比為1∶1∶1，光周期為14 h /10 h（日／夜），溫度為26℃，濕度為60%。本氏煙草（Nicotiana benthamiana Domin.）、根癌農桿菌EHA105、酵母菌株Y2HGold、酵母雙雜交載體pGBKT7均為本實驗室保存。大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京全式金公司。DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、純化試劑盒均購自OMEGA公司。克隆載體pMD19-T、反轉錄試劑盒、限制性內切酶Nco I、酵母轉化試劑盒、DL5000 DNA Marker均購自TaKaRa公司。無縫連接酶購自碧云天公司。實驗所用引物（表1）利用Primer Premier 5.0設計并通過北京睿博興科生物技術有限公司合成。

1.2實驗方法

1.2.1基因克隆以大葉落地生根cDNA為模板，KdSRG1-F和KdSRG1-R為引物，利用2×GoldStar best MasterMix進行PCR擴增目的基因。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后與pMD19-T載體連接，連接產物轉化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取大小均一的單克隆菌落進行PCR驗證，選取單一條帶且長度符合要求的菌液送至生物公司測序。

1.2.2生物信息學分析通過NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查找KdSRG1同源蛋白進行比對分析，并用MEGA 11構建系統(tǒng)進化樹，方法采用鄰接法，校驗參數bootstrap設置為1 000。使用ExPASy數據庫的ProtParam（https：//www.expasy.org/resources/protparam）和SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分別對蛋白一級、二級結構的特性進行分析；使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對蛋白三級結構的特性進行分析。利用TMHMM Server V2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測其跨膜結構。利用iPSORT（https：//www.genscript.com/psort.html）進行亞細胞定位預測。通過SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）預測目的基因信號肽。通過ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白的疏水性和親水性。

1.2.3啟動子順式作用元件分析為了進一步了解大葉落地生根KdSRG1的功能，通過染色體步移法獲得其上游1 427 bp的啟動子序列。利用在線分析數據庫PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對KdSRG1上游的啟動子進行順式作用元件分析。

1.2.4pGBKT7-KdSRG1誘餌表達載體的構建提取測序正確的菌液的質粒，命名為pMD19-T-KdSRG1，并以其為模板，KdSRG1-BD-F和KdSRG1-BD-R為引物進行PCR擴增。利用限制性內切酶Nco Ⅰ對pGBKT7載體進行酶切處理，對PCR產物和酶切產物進行純化，使用通過In-Fusion連接酶將兩個產物連接。將其轉化入大腸桿菌DH5α，均勻涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，挑取大小均一的單克隆菌落，以T7和3′BD為引物進行PCR檢測，選取長度符合要求的菌液送至生物公司測序。

1.2.5酵母轉化及自激活檢測將測序正確的菌液進行質粒提取，將其命名為pGBKT7-KdSRG1。醋酸鋰轉化法制備Y2HGold酵母感受態(tài)，并將pGBKT7-KdSRG1和pGBKT7空載體轉入酵母感受態(tài)細胞，均勻涂布于SD/-Trp平板上，置于30℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單克隆菌落擴大培養(yǎng)并酵母去壁，進行PCR檢測，選取長度符合要求的菌液送至生物公司測序。

將成功轉入pGBKT7-KdSRG1和pGBKT7空載體的酵母單克隆菌落置于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，菌液分別稀釋至1/10，1/100，1/1 000，并分別取10 μL接種于SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上。置于30℃下倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察其生長狀況和顏色。

1.2.6亞細胞定位以pMD19-T-KdSRG1為模板，KdSRG1-3302Y-F和KdSRG1-3302Y-R為引物進行PCR擴增，構建35S：：KdSRG1-GFP表達載體，并以35S：：GFP為對照空載體，將其轉化EHA105農桿菌感受態(tài)，注射煙草葉片并置于黑暗條件中培養(yǎng)48 h。通過共聚焦顯微鏡（Leica，SP-8）觀察葉片細胞中GFP信號的分布情況。

1.2.7表達分析選取生長狀況良好并且成熟的大葉落地生根的根、莖、葉、不定芽組織，分別進行RNA提取，之后對其進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察18S和28S條帶。將完整性較好的RNA反轉錄為cDNA，并以其為模板，大葉落地生根Kd-actin基因內參，KdSRG1-RT-F和KdSRG1-RT-R為引物進行實時熒光定量PCR。反應體系：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，cDNA1 μL，ddH2O 7 μL。實驗數據用2-△△CT法分析結果，通過Microsoft Excel 2019進行計算和圖表繪制，并采用SPSS 25.0進行差異顯著性分析（Plt;0.05）。

2結果與分析

2.1基因克隆以大葉落地生根第一鏈cDNA為模板，KdSRG1-F和KdSRG1-R為引物進行PCR擴增，經過純化并與pMD19-T載體連接，電泳檢測后可見大小約為500 bp單一條帶（圖1）。將上述菌液送至生物公司，測序結果正確，表明成功克隆KdSRG1基因。

2.2生物信息學分析KdSRG1基因開放閱讀框共219 bp，編碼72個氨基酸（圖2）。其正電荷氨基酸殘基數量為10，負電荷氨基酸殘基數量為11，分子式為C₃₄₇H₅₇₀N₁₀₀O₁₁₄S₆，蛋白分子質量為8 159.30 Da，理論等電點為5.76；脂溶系數為71.81，不穩(wěn)定系數為58.55。蛋白質的疏水性和親水性分析（圖3）表明，第20位的蘇氨酸親水性最強，分值為-2.967，第54位的丙氨酸疏水性最強，分值為1.522。從整體來看，親水區(qū)域面積大于疏水區(qū)域，且含有一個絕對分值大于2的強親水區(qū)域。因此，KdSRG1蛋白是一個親水性的不穩(wěn)定酸性蛋白。二級結構（圖4A）及三級結構預測（圖4B）表明，該蛋白由4種結構元件組成，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲均為41.67%，延伸鏈12.50%，β-轉角為4.17%。KdSRG1蛋白的跨膜結構預測和信號肽預測結果表明，該蛋白不具有跨膜結構，并且不含有信號肽及其剪切位點。亞細胞定位預測結果顯示，該蛋白定位在細胞核的可能性最大。通過MEGA 11以鄰接法構建KdSRG1蛋白與其他物種SRG1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5），結果表明KdSRG1蛋白與其他物種SRG1蛋白的親緣關系較遠，具有物種上的特異性。

2.3KdSRG1啟動子區(qū)的順式作用元件分析為了探究KdSRG1基因的功能，通過染色體步移法獲取KdSRG1基因上游1 427 bp的啟動子序列，并使用PlantCARE對其進行分析。啟動子的順式作用元件分析（表2）結果表明，KdSRG1啟動子中除了含有核心啟動子元件TATA-box，CAAT-box和A-box以外，其他的順式作用元件主要分為4類，分別是光響應元件、植物激素響應元件、逆境脅迫響應元件和植物生長發(fā)育響應元件。該啟動子中存在多種光響應元件，暗示其具有多種方式響應光信號。由此推測，該啟動子調節(jié)下游的KdSRG1基因，可能在光響應和脫落酸（Abscisic acid，ABA）、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）響應方面發(fā)揮重要作用，并且調控其參與分生組織表達和柵欄細胞分化過程，同時逆境脅迫響應元件的存在可能會增強植物抗逆性。

2.4表達載體的構建以pMD19-T-KdSRG1為模板擴增的PCR產物與pGBKT7載體純化連接，并轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落進行PCR驗證，可見約500 bp的單一條帶（圖6）。上述菌液送至生物公司測序，測序結果正確，表明成功構建含KdSRG1基因的誘餌表達載體，命名為pGBKT7-KdSRG1。

2.5誘餌表達載體的自激活檢測將成功轉化的酵母單克隆菌落擴大培養(yǎng)并稀釋后，接種于SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上，觀察酵母菌生長情況。酵母自激活檢測（圖7）結果顯示，轉入pGBKT7-KdSRG1和pGBKT7空載體的酵母菌在SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上正常生長且不顯示藍色，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上生長受到抑制且不顯示藍色，說明KdSRG1基因不具自激活活性。

2.6亞細胞定位蛋白質在細胞中的定位決定了其行使功能的部位，因此蛋白質亞細胞定位與其功能密切相關。為研究KdSRG1蛋白在細胞中的定位情況，將成功轉入35S：：KdSRG1-GFP和35S：：GFP重組質粒的農桿菌菌液注射本氏煙草葉片的背面，黑暗條件下培養(yǎng)48 h，并通過共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白的分布情況。亞細胞定位結果（圖8）顯示，在煙草葉片細胞中，轉化質粒35S：：GFP對照空載體的熒光信號分布整個細胞中，而轉化質粒35S：：KdSRG1-GFP表達載體的熒光信號均分布在細胞質和細胞核中，表明KdSRG1蛋白在細胞核和細胞質中都有表達。

2.7表達分析為了研究大葉落地生根KdSRG1基因在不同組織的表達情況，提取成熟大葉落地生根的根、莖、葉、不定芽組織RNA，并對其進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結果（圖9A）表明，28S和18S條帶完整明亮，無明顯拖尾現象，表明RNA完整性較好，可用于后續(xù)實驗。將RNA反轉錄為cDNA后，以其為模板，大葉落地生根Kd-actin基因為內參進行實時熒光定量PCR。分析結果（圖9B）表明，KdSRG1基因在根、莖、葉、不定芽中均有表達但相對表達量存在差異，不定芽和葉中相對表達量顯著高于在根和莖中的相對表達量，推測該基因可能參與不定芽和葉的生長調控。

3討論

2-ODD家族基因的保守性為19%～75%，保守性上具有一定差異，因此不同的2-ODD蛋白具有不同的生物活性［19］。本研究成功克隆KdSRG1基因，通過生物信息學分析初步預測其功能。KdSRG1基因開放閱讀框219 bp，編碼72個氨基酸殘基，其理化性質分析表明，KdSRG1蛋白為親水性的酸性蛋白，具有較強的親水性。進化樹分析結果表明，大葉落地生根中的KdSRG1蛋白具有物種上的特異性。亞細胞定位顯示大葉落地生根KdSRG1蛋白定位在細胞核和細胞質，表明其在細胞核和細胞質上行使功能。熒光定量結果表明，KdSRG1基因在大葉落地生根的各個組織中均有表達，但各個組織中相對表達量不同（不定芽＞葉＞根＞莖）。該基因在不定芽和葉中的相對表達量較高，具有組織差異性表達，可能參與大葉落地生根不定芽和葉的發(fā)育調控。

啟動子能調控下游基因的特異表達，是轉錄調控的核心組成部分。植物在遭受逆境脅迫時，啟動子能夠調控脅迫應答基因的表達，具有重要的地位［20］。通過啟動子的順式作用元件預測，可以初步分析基因的表達機制及功能。KdSRG1啟動子區(qū)的順式作用元件分析顯示，該啟動子除了含有核心啟動子元件TTATA-box，CAAT-box和A-box以外，還含有光響應元件、MeJA響應響應元件、ABA響應元件、分生組織表達響應元件和柵欄細胞分化響應元件等。光可以作為環(huán)境信號來調控相關基因的表達，進而調控植物的生長發(fā)育［21］。KdSRG1啟動子含有多個光相應元件，暗示該基因可能通過多種方式參與植株的光調控途徑。崔澤田等［22］研究發(fā)現，在甘蔗（Saccharum spontaneum L.）中，大部分2-ODD加氧酶基因家族成員的啟動子均含有ABA響應元件ABRE、茉莉酸響應元件CGTCA-motif和TGACG-motif，這與KdSRG1啟動子中的激素響應元件相同。ABA和茉莉酸類物質可以調控植物的一些生長發(fā)育過程，對植物抗逆性有十分重要的意義［23-24］。因此，推測KdSRG1基因調控植物分生組織表達和柵欄細胞分化過程，并且其表達可能與光信號、ABA和MeJA有關，同時可能在植物逆境脅迫調控方面發(fā)揮作用。蛋白質相互作用構成部分細胞生化反應網絡，進而在生命體的生命過程中發(fā)揮重要作用，探究蛋白質互作能夠加深對細胞分子機制的認知。酵母雙雜交技術是鑒定或者篩選蛋白質互作的常規(guī)方法之一，這種技術利用酵母轉錄調控因子的組件式結構特征，具有廣泛適用性和巨大的潛力［25-26］。此技術具有敏感性強和效率高等優(yōu)點，并且可以篩選cDNA文庫識別互作蛋白，通過對編碼目的蛋白的cDNA進行操作，從而簡化下游研究，因此得到越來越廣泛的應用［26-27］。本研究通過克隆大葉落地生根KdSRG1基因，構建pGBKT7-KdSRG1誘餌表達載體并轉入酵母感受態(tài)細胞，進行自激活檢測表明其無自激活活性，可用于后續(xù)的篩選互作蛋白實驗。本項目組將進行互作蛋白篩選實驗，并進行噴施外源ABA和MeJA等進行外施激素等表達分析實驗，進一步解釋KdSRG1基因調控的分子機制。本研究為深入探究KdSRG1基因的功能奠定了基礎，但關于其在大葉落地生根中的具體功能及調控機制還需要深入研究。

4結論

本研究成功克隆大葉落地生根KdSRG1基因。該基因的啟動子含有光響應元件、MeJA響應響應元件和ABA響應元件等，暗示該基因可能在植物的光調控和逆境脅迫調控方面發(fā)揮作用。KdSRG1基因在不定芽和葉中的相對表達量顯著高于在根和莖中的相對表達量，說明其參與不定芽和葉的生長發(fā)育過程。KdSRG1蛋白為親水性的不穩(wěn)定酸性蛋白，無信號肽和跨膜結構，在細胞核和細胞質上發(fā)揮作用，并且具有物種上的特異性。酵母轉錄自激活檢測結果顯示，該蛋白不具備自激活活性，可用于后續(xù)的酵母雙雜實驗篩選互作蛋白。本研究為進一步探究KdSRG1基因奠定了理論基礎。

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（責任編輯 閔芝智）