紫花苜蓿MsMYB33基因克隆、亞細胞定位及轉錄自激活檢測

摘要：MYB（V-myb Avian myeloblastosis viral Oncogene Homolog）轉錄因子數量較多、功能多樣，在植物的發育過程中起著十分重要的作用。為了探究紫花苜蓿（Medicago sativa）中MsMYB33基因的亞細胞定位及自激活特性，本研究從紫花苜蓿中克隆MsMYB33基因，該基因開放閱讀框為1 641 bp，編碼多肽含有546個氨基酸。遺傳進化樹顯示MsMYB33蛋白與鷹嘴豆（Cicer arietinum）中的CaMYB33蛋白同源關系最高。將MsMYB33與黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）進行融合表達，結果顯示：MsMYB33蛋白定位于細胞核。通過DNA重組技術成功構建pGBKT7-MYB33酵母表達載體，并轉化到Y2HGold酵母菌中。酵母自激活檢測結果顯示，MsMYB33具有自激活活性，進一步分析發現激活區域位于C端。本研究為進一步研究紫花苜蓿MsMYB33基因及MYB轉錄因子家族提供了科學依據。

關鍵詞：紫花苜蓿；MsMYB33基因；核定位；自激活活性

中圖分類號：S963.22+3.3文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）05-1331-07

Cloning，Subcellular Localization and Autonomous Transcriptional Activation

Testing of MsMYB33 Gene from Medicago sativa

WANG Xin-yi WANG Xiao-qian LIU Ya-ling CHAO Yue-hui

（1. School of Grassland Science，Beijing Forestry University， Beijing 100083， China; 2. Beijing Tide Pharmaceutical Co.， Ltd，

Beijing 100176， China; 3. Inner Mongolia M-Grass Ecology And Environment （Group） Co.， Ltd， Hohhot， Inner Mongolia 010010， China）

Abstract：MYB （V-myb Avian myeloblastosis viral Oncogene Homolog） transcription factors，with numerous members and diverse functions，play important roles in the developmental processes of plants. To investigate the subcellular localization and self-activation properties of the MsMYB33 gene in Medicago sativa，the MsMYB33 gene was cloned from M. sativa，which had an open reading frame of 1，641 bp and encoded a polypeptide with 546 amino acids. Upon the phylogenetic analysis，that MsMYB33 protein was most closely related to the CaMYB33 protein in Cicer arietinum. MsMYB33 was fused with yellow fluorescent protein （YFP） for expression，and the results showed that the MsMYB33 protein was localized in the nucleus. A pGBKT7-MYB33 yeast expression vector was successfully constructed by DNA recombination technology and transformed into the Y2HGold yeast strain. Yeast self-activation assays showed that MsMYB33 had a self-activation activity，and from the further analysis that the self-activation domain of MsMYB33 was located at the C-terminus. This study provided a scientific basis for further research on the MsMYB33 gene and the MYB transcription factors family in M. sativa.

Key words：Medicago sativa;MsMYB33 gene;Localization in nuclear;Self-activation activity

MYB（V-myb Avian myeloblastosis viral Oncogene Homolog）轉錄因子是一類數量較多、功能多樣的轉錄因子家族，其廣泛地參與植物的代謝調控，在植物生長發育和脅迫響應等多個方面發揮著十分重要作用。MYB轉錄因子家族命名于其保守的MYB結構域。第一個被發現的MYB基因是在禽成髓細胞瘤病毒（Avian myeloblastosis）的v-Myb癌基因［1］。此后，多個MYB基因在動物、植物、真菌等多個物種中被發現。第一個在植物中被發現的MYB類基因是玉米ZmMYBC1基因，其與花青素的生物合成有關［2］。MYB轉錄因子含有N端的DNA結合結構域和C端的調控區域［3］，N端的MYB結構域高度保守，其通常含有1～4個不完全重復序列（R結構）［4］。R結構由50～53個氨基酸組成，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列的折疊蛋白，其中氨基酸殘基以螺旋-轉角-螺旋（HTH）的形式參與到與DNA的結合過程，間隔序列則由一個色氨酸殘基組成，每隔18個氨基酸會間隔著一個具有疏水作用的色氨酸殘基，對維持HTH的構型具有重要意義［5-6］。可根據重復序列（R結構）的個數和位置將MYB轉錄因子分為四類：1R-MYB/MYB-related，R2R3-MYB，3R-MYB，4R-MYB［7］。R2R3-MYB轉錄因子是MYB轉錄因子家族中數量最多的，它們在N端都含有兩個R結構，并且一般在C端都具有轉錄激活功能，廣泛地參與細胞分化、次生代謝、環境脅迫、抵抗病蟲害、激素應答等過程［7］。MYB33是R2R3-MYB亞家族中的成員，前人研究發現，一些microRNA能夠通過與MYB基因編碼的mRNA相互識別并結合，在轉錄后水平對MYB進行表達調控。MYB33是miR159（microRNA159）的主要靶基因，研究表明MYB33的表達會帶來株型矮小、葉子卷曲、生長延緩等問題，MYB33在擬南芥（Arabidopsis thaliana）營養組織中大量轉錄，miR159通過降解MYB33來保證擬南芥的正常生長［8］。MYB33能夠參與植物開花調控途徑，擬南芥AtMYB33與miR159不完全結合會影響花粉的發育，進而導致植物雄性不育［9］；在擬南芥中MYB33可以結合在LFY的啟動子上激活其表達并且促進開花［10］；在番茄（Solanum lycopersicum）中SlMYB33的過量表達可以延遲開花時間、促進果實增大［11］。MYB33能夠參與植物抗性調控途徑，在小麥（Triticum aestivum）中過表達TaMYB33能夠提高轉基因植物抗旱性和耐鹽性［12-13］；在馬鈴薯（Solanum tuberosum）中干旱脅迫下miR159表達下降，而StMYB33表達水平上升［14］；在番茄中鑒定了抗番茄曲葉新德里病毒（ToLCNDV）的關鍵R基因SlSw5a，并發現MYB33能夠通過調控SlSw5a基因表達，進而影響植物對ToLCNDV的抗性［15］。進一步調控網絡分析表明：MYB33與TCP4轉錄因子能夠獨立或互作形成異源二聚體激活miR167，進而調控植物花器官發育［16］。研究發現ABA關鍵信號分子ABI5直接受MYB33的調控，MYB33通過直接結合ABI5啟動子GTAC基序，激活ABI5的表達，進而影響植物營養生長階段轉變［17］。

紫花苜蓿享有“牧草之王”的美稱，是畜牧業和奶業的重要原料。本研究通過對紫花苜蓿MsMYB33基因的克隆、生物信息學分析、亞細胞定位、轉錄自激活檢測為MYB轉錄因子提供理論參考，同時為深入分析MYB互作分析和調控網絡提供了基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料及試劑

本試驗所用的紫花苜蓿（品種：‘中苜1號’）為北京林業大學草業與草原學院保存。克隆載體pMD19-T，T4 DNA連接酶、限制性內切酶酶Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ、反轉錄試劑盒、酵母轉化試劑盒等購于Takara公司。細胞質粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、PCR純化試劑盒等購買于OMEGA公司。大腸桿菌DH5α感受態、Y2HGold酵母菌、EHA105農桿菌等均為北京林業大學草業與草原學院實驗室保存。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計基于已經公布的紫花苜蓿參考基因組序列，應用軟件Primer Premier 5進行引物設計。其中，MsMYB33-F和MsMYB33-R用于MYB33基因克隆；3302Y-MYB33-F和3302Y-MYB33-R用于植物表達載體構建和亞細胞定位分析；pGBKT7-MYB33-F和pGBKT7-MYB33-R用于MsMYB33全長蛋白質自激活檢測；pGBKT7-MYB33-N-F和pGBKT7-MYB33-N-R用于MsMYB33蛋白N端自激活檢測；pGBKT7-MYB33-C-F和pGBKT7-MYB33-C-R用于MsM-YB33蛋白C端自激活檢測（表1）。

1.2.2MsMYB33基因克隆選用生長狀態良好的紫花苜蓿葉片，按照試劑盒的說明提取總RNA并進行反轉錄得到第一鏈cDNA。以MsMYB33-F和MsMYB33-R為引物對cDNA進行擴增，反應程序為：95℃ 10 min；95℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min；30個循環；72℃ 5 min；4℃保溫。將PCR產物連接到pMD-19T克隆載體再轉入到大腸桿菌DH5α中，PCR檢測后送至北京睿博興科生物公司測序并比對測序結果，將構建的克隆載體命名為pMD-MYB33，并保菌及提取質粒。

1.2.3生物信息學分析MsMYB33蛋白保守結構域分析使用NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）；MsMYB33蛋白二級、三級結構預測使用SOPMA（https：//prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）；MsMYB33蛋白各級結構的特性分析使用ExPASy數據庫（http：//expasy.org/）；預測MsMYB33蛋白在細胞內的定位情況使用Cell-PLoc 2.0網站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）；MsMYB33信號肽的預測使用SignalP 5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）；系統進化樹分析使用MEGA 7.0軟件。

1.2.43302Y-MYB33載體構建及亞細胞定位使用3302Y-MYB33-F和3302Y-MYB33-R引物，以pMD-MYB33為模板進行擴增，構建用于亞細胞定位的植物表達載體3302Y-MYB33。提取含有YFP的植物表達載體3302Y質粒，在37℃條件下Nco I酶切15 min，純化后使用無縫連接酶50℃條件下連接15 min，轉化大腸桿菌DH5α中并涂布在含有卡那霉素的LB固體培養基上。對單菌落進行PCR驗證后送至北京睿博興科生物公司測序，比對測序結果并保菌。對測序檢測構建成功的3302Y-MYB33載體的大腸桿菌提取質粒轉化EHA105農桿菌，將農桿菌注射健康生長的煙草葉片并放置于避光環境下培養48 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察YFP信號在細胞中的分布情況。

1.2.5pGBKT7-MYB33載體的構建使用pGBKT7-MYB33-F和pGBKT7-MYB33-R引物，以pMD-MYB33為模板構建pGBKT7-MYB33載體。提取pGBKT7載體質粒，在37℃條件下使用Nco I和EcoR I雙酶切15 min，純化后使用無縫連接酶在50℃條件下連接15 min，轉化大腸桿菌DH5α中并涂布在含卡那霉素的LB固體培養基上。對單菌落進行PCR驗證并送至北京睿博興科生物公司測序，比對測序結果并保菌。

1.2.6酵母的轉化及自激活分析使用質粒提取試劑盒從測序正確的大腸桿菌中提取pGBKT7-MYB33質粒，并使用酵母轉化試劑盒將pGBKT7-MYB33轉入到Y2HGold酵母菌株中，涂布在SD/-Trp培養基上并放置于30℃酵母培養箱，PCR檢測單菌落后保存測序正確的pGBKT7-MYB33酵母菌液。挑取成功轉化的pGBKT7-MYB33酵母單克隆菌落于SD/-Trp液體培養基中，搖菌后分濃度梯度涂于SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA培養基上，在29.5℃酵母培養箱中培養2～3 d后，對含有pGBKT7-MYB33的Y2HGold酵母菌進行觀察并記錄分析。

1.2.7自激活結構域分析MsMYB33基因編碼546個氨基酸，MYB33是典型的R2R3-MYB轉錄因子，R2R3-MYB轉錄因子在N端含有保守結構域且一般在C端具有轉錄激活功能［7］。以位于MsMYB33的N端1～137氨基酸區域構建pGBKT7-MYB33-N載體，以位于MsMYB33的C端138～546氨基酸區域構建pGBKT7-MYB33-C載體，分別對MsMYB33蛋白不同區域進行轉錄自激活檢測。按照1.2.5操作進行不同結構域酵母表達載體構建，并分別轉入到酵母菌Y2H菌株中進行篩選和檢測分析。分別挑取成功轉化的pGBKT7-MYB33-N，pGBKT7-MYB33-C酵母單克隆菌落于SD/-Trp液體培養基中，搖菌后分濃度梯度涂于SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA培養基上，在29.5℃酵母培養箱中培養2～3 d后，分別對pGBKT7-MYB33-N，pGBKT7-MYB33-C的Y2HGold酵母菌株的生長狀態和菌株顏色進行觀察記錄及分析。

2結果與分析

2.1MsMYB33基因克隆對提取的紫花苜蓿總RNA進行反轉錄，以獲得的cDNA為模版，MsMYB33-F和MsMYB33-R為引物，PCR擴增獲得約1 600 bp大小的條帶（圖1），將其連接至pMD19-T克隆載體并轉化大腸桿菌，送至北京睿博興科生物公司測序后結果正確，表明成功克隆MsMYB33基因。

2.2生物信息學分析MsMYB33基因開放閱讀框為1 641 bp，共編碼546個氨基酸。保守結構域分析顯示MYB33蛋白屬于REB1超家族（圖2）。MYB33蛋白分子式為C2666H4056N742O859S28，分子量為61.14 kDa，帶負電荷的殘基總數為68個，帶正電荷的殘基總數為48個，理論等電點為5.34。MsMYB33蛋白質不穩定指數為55.58，這說明MsMYB33蛋白質結構不穩定。隨機線圈在MsMYB33的二級結構組件中的占比最高，為66. 48%，α-螺旋占比為24.18%，延伸鏈占比為5.86%，β-轉角占比為3.48%（圖3）。蛋白質三級結構結果預測MsMYB33蛋白由螺旋和環構成（圖4），無信號肽，定位于細胞核。MsMYB33蛋白質的疏水性圖譜中，數值大于0表示疏水性，小于0則表示親水性，總平均親水性為0.752，則MsMYB33可能為疏水蛋白。系統進化樹結果顯示紫花苜蓿中的MYB33蛋白與鷹嘴豆（Cicer arietinum）中氨基酸相似度最高（圖5），表明紫花苜蓿MsMYB33蛋白與鷹嘴豆中CaMYB33蛋白的親緣關系最為接近。

2.4轉錄自激活檢測轉入pGBKT7-MYB33質粒的Y2HGold酵母菌在SD/-Trp的培養基上生長正常，證明MsMYB33蛋白質沒有毒性；在SD/-Trp/X-α-Gal培養基內為正常生長的藍色菌體，同時在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA培養基內仍生長且顯現藍色（圖7）。以上結果證實MsMYB33存在轉錄自激活活性。

2.5激活結構域分析含有pGBKT7-MYB33-N載體質粒的Y2HGold酵母菌在SD/-Trp的培養基上生長正常；在SD/-Trp/X-α-Gal培養基上為白色菌體并且不能呈現藍色；在SD/-Trp /X-α-Gal/AbA培養基上不能形成正常菌斑并且不顯現藍色（圖8）。此結果證實MsMYB33的N端不存在轉錄激活結構域。含有pGBKT7-MYB33-C載體質粒的Y2HGold酵母菌在SD/-Trp的培養基上生長正常；在SD/-Trp/X-α-Gal培養基上為正常生長的藍色菌體；在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA培養基仍顯現藍色（圖8）。此結果證實MsMYB33蛋白C端存在激活結構域。

3討論

在MYB轉錄因子家族中R2R3-MYB轉錄因子的數量最多，R2R3-MYB轉錄因子廣泛地參與細胞分化、次生代謝、激素應答、環境脅迫、抵抗病蟲害等［18-19］。R2R3-MYB轉錄因子多數通過調控細胞核基因的轉錄來發揮功能，嚴莉對黑果枸杞MYB轉錄因子進行亞細胞定位預測，在37個定位于細胞核中的MYB轉錄因子中R2R3-MYB轉錄因子多達24個，占總數的64.9%［20］。邢錚對馬鈴薯中StR2R3-MYB轉錄因子的亞細胞定位實驗發現融合蛋白定位于細胞核內［21］。生物信息學分析顯示紫花苜蓿MsMYB33具有典型的R2R3-MYB轉錄因子特征，同時亞細胞定位實驗結果表明MsMYB33蛋白定位于細胞核，該定位結果與MsMYB33扮演轉錄因子的角色一致。R2R3-MYB轉錄因子含有保守N端和多變C端的模塊序列：N端含有兩個MYB結構域；C端功能區含有激活或抑制功能結構域［22］。酵母雙雜交技術是研究蛋白質相互作用的有效方法。如果誘餌蛋白本身具有轉錄激活功能會激活下游啟動子調節的報告基因，所以在利用誘餌蛋白進行酵母雙雜篩選前，為降低假陽性結果出現的幾率，首先要排除蛋白的自激活功能［23］。為保證實驗結果的可信度，避免目的基因具有對酵母激活的假陽性，需要對目的基因進行自激活檢驗［24］。丁愷對丹參（Salvia miltiorrhiza）中SmMYB33的酵母自激活實驗發現SmMYB33具有自激活活性［25］。將pGBKT7-MYB33載體轉入到Y2H酵母菌中進行MsMYB33轉錄自激活檢測，結果表明MsMYB33存在轉錄自激活活性。通過分析MsMYB33轉錄因子結構，按照不同的區域分為N端和C端，分別對兩個蛋白質結構域進行轉錄自激活分析，結果表明，MsMYB33在C端存在轉錄激活結構域，而MsMYB33的N端不存在轉錄激活結構域。這與R2R3-MYB轉錄因子在N端含有MYB保守結構域且一般在C端具有轉錄激活功能的結構特征相吻合，以上工作為下一步進行酵母雙雜交的篩庫工作奠定了基礎。為了更深入研究MsMYB33基因在紫花苜蓿中發揮的作用，下一步可構建過表達載體并對紫花苜蓿進行遺傳轉化，同時也可以進行酵母雙雜交實驗篩選MsMYB33的互作蛋白，進一步探究紫花苜蓿MsMYB33基因調控、蛋白互作、信號轉導和分子調控機制。

4結論

本研究從紫花苜蓿中成功克隆MsMYB33基因，該蛋白定位于細胞核，具有轉錄自激活活性，其激活域位于蛋白質C端。該工作為后續篩選MsMYB33互作蛋白質提供了研究基礎，也為進一步研究MsMYB33基因的功能和調控機制提供深入的理解。

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（責任編輯 閔芝智）