類風濕關節炎患者腸道菌群分布及與血清炎性指標、免疫指標水平的關系

蔣磊，方興剛，蘭培敏，陳漢玉

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是腫脹、神經痛、僵硬、功能減退和軟骨退化，這些改變均會導致功能障礙[1-2]。類風濕關節炎的發病機制尚不完全清楚，可能是由于遺傳環境和免疫因素之間的復雜相互作用，導致免疫系統失調和缺乏自身免疫耐受[3]。已有研究顯示，由于胃腸道炎性反應，類風濕關節炎患者的腸道滲透性增強，導致食物抗原和高度危險的微生物通過血液傳播[4]。胃腸道微生物的多樣性和密度較高，微生物群參與許多生理過程，包括消化和代謝，以及免疫系統的發育和調節[5]。因此，現研究類風濕關節炎患者腸道菌群多樣性、分布特征及其與炎性指標、免疫指標的相關性，以期為類風濕關節炎的臨床治療提供新的思路，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年2月—2022年5月湖北省十堰市太和醫院/湖北醫藥學院附屬醫院中西醫結合科收治的類風濕關節炎患者86例為觀察組，男20例，女66例，年齡20～55(39.78±9.30)歲；病程1～6(3.12±0.94)年；關節功能：Ⅰ級39例，Ⅱ級37例，Ⅲ級10例；合并高血壓10例，合并高脂血癥4例；有家族遺傳史2例；受累關節數1～12(6.74±1.13)個。另選取醫院同期腸道功能正常的健康體檢者78例為健康對照組，男18例，女60例，年齡21～56(40.02±8.96)歲。2組性別、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(2019-0127)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①類風濕關節炎診斷符合“2018中國類風濕關節炎診療指南”[6]；②各研究對象臨床資料完整，且自愿參加本研究；③無節食、偏食等不良飲食習慣者；④6個月內未進行胃腸道手術或灌腸者。(2)排除標準：①近1個月內有益生元、益生菌、抗生素或其他微生態調節劑服用史者；②有惡性腫瘤、急慢性感染或免疫相關疾病者；③處于妊娠期或哺乳期者；④合并骨關節炎、痛風、強直性脊柱炎等其他關節疾病者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 16s rDNA測序：采集各研究對象糞便，對糞便DNA的16s rDNA基因V3～V4可變區行PCR擴增，擴增程序：95℃ 1 min；95℃ 30 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s，25個循環。上游引物序列：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，下游引物序列：5’-GGACTACCGGTACGAGACTC-3’。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其擴增效率及產物大小。定量后采用美國Illumina公司生產的Illumina HiSeq 4000pair-end2×150 bp上機進行測序，采用UPARSE軟件進行可執行的分類操作單位(operational taxonomic units，OTUs)聚類，采用Mothur軟件計算Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數進行多樣性分析。

1.3.2 腸道菌群數量檢測：采集研究對象新鮮糞便1 g，采用厭氧菌稀釋液將其溶解，振蕩器充分搖勻后使用生理鹽水采用10倍連續法稀釋為梯度濃度(10-8～10-1)，將不同稀釋度下的標本各取50 μl置于乳桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、真桿菌選擇性培養基平板中，厭氧菌37℃厭氧箱培養48 h，需氧菌37℃一般恒溫箱中培養24 h，將選定的各細菌進行定量檢測(訊數科技公司生產的icount20型菌落計數器)，結果采用每克糞便中菌落形成單位對數(lgCFU/g)表示。

1.3.3 血清炎性指標、免疫指標水平檢測：患者入組24 h內、健康對照組體檢當日采集其空腹靜脈血，3 000 r/min離心15 min后收集血清，于-80℃凍存。采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測白介素-6(interleukin-6，IL-6，試劑盒購自江西艾博因生物科技有限公司)、IL-8(試劑盒購自上海富雨生物科技有限公司)水平，檢測儀器為美國Molecular Devices公司生產的TY10SpectraMax M5酶標儀。C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、IgE、IgM、IgG采用化學發光法檢測，儀器及試劑盒由美國Beckman-Coulter公司生產。紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)采用紅外線障礙法檢測，以意大利Vital公司生產的MONITOR-20自動血沉儀檢測，均嚴格按儀器及配套試劑盒使用說明進行操作。

2 結 果

2.1 2組腸道菌群多樣性比較 觀察組Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數均顯著低于健康對照組(P<0.05)，見表1。

表1 健康對照組和觀察組腸道菌群多樣性分析比較

2.2 2組腸道菌群數量比較 觀察組乳桿菌、雙歧桿菌數量均低于健康對照組，腸球菌、真桿菌數量均高于健康對照組(P<0.01)，見表2。

表2 健康對照組和觀察組腸道菌群數量比較

2.3 2組血清炎性指標比較 觀察組血清CRP、ESR、IL-6、IL-8水平均高于健康對照組(P<0.01)，見表3。

表3 健康對照組和觀察組血清炎性指標比較

2.4 2組血清免疫指標比較 觀察組血清IgA、IgE、IgM、IgG水平均高于健康對照組(P<0.01)，見表4。

表4 健康對照組和觀察組血清免疫指標比較

2.5 類風濕關節炎患者腸道菌群與炎性指標、免疫指標水平的相關性 Pearson相關分析結果顯示，類風濕關節炎患者乳桿菌、雙歧桿菌與炎性指標CRP、ESR、IL-6、IL-8及免疫指標IgA、IgE、IgM、IgG水平均呈負相關，腸球菌、真桿菌與上述指標均呈正相關(P<0.01)，見表5。

表5 類風濕關節炎患者腸道菌群與炎性指標、免疫指標水平的相關性

3 討 論

類風濕關節炎是一種在世界范圍內流行的炎性疾病，嚴重威脅人類健康，雖然傳統藥物治療可以緩解類風濕關節炎癥狀并減緩進展，但高劑量藥物和頻繁給藥會導致不良反應，因此探究類風濕關節炎治療新方法勢在必行[7-8]。微生物組與宿主免疫系統的相互作用通過微生物抗原和代謝物發生，這些相互作用的變化可能破壞微生物組和宿主免疫系統之間的平衡，進而可能導致類風濕關節炎免疫發病[9-10]。目前已有越來越多的臨床研究人員認識到腸道微生物群在類風濕關節炎進展及預后中的關鍵作用。

16s rDNA是用于表征生物物種的特征序列，其包含的9個高變區可有效提供物種特異性的特征核酸序列，是研究細菌分類鑒定和系統發育的有效指標[11-12]。本研究采用16s rDNA測序技術，結果顯示類風濕關節炎患者中表征物種豐富度及表征物種多樣性的各指數均低于健康人群，與康海英等[13]研究結果部分一致。初步提示類風濕關節炎患者體內腸道菌群失調，腸道菌群的組成可能通過改變微生物功能參與類風濕關節炎疾病進展。益生菌被描述為“當以適當的數量提供時，能夠賦予健康益處的活微生物”，雖然目前尚不清楚益生菌的作用如何，但公布的數據表明，益生菌可以降低腸道通透性，減輕腸道內皮細胞損傷，并影響機體免疫系統[14-15]。本研究結果中類風濕關節炎患者腸道菌群數量與健康人群差異有統計學意義。分析其可能原因為：類風濕關節炎患者體內出現腸道菌群失調，而腸道菌群組成的改變可能通過影響微生物對腸道通透性的調節功能來促進類風濕關節炎的發生及發展。推測乳桿菌作為益生菌與機體免疫應答相關，其組成及數量變化可能影響機體特異性及非特異性免疫應答，在類風濕關節炎的病情發展中起關鍵作用。

此外，本研究結果顯示，類風濕關節炎患者血清炎性指標CRP、ESR、IL-6、IL-8及免疫指標IgA、IgE、IgM、IgG水平顯著升高，與劉素芳等[16]研究結果部分一致，表明類風濕關節炎的發生發展與炎性反應水平及體液免疫調節作用增加有關，在類風濕關節炎病情的演變過程中可能會促使關節炎性反應及免疫作用的長期持續和加重，但其在類風濕關節炎中相互作用的具體機制尚不明確，有待進一步探討。結合本研究中腸道菌群與炎性指標、免疫指標的相關性結果，分析認為其可能作用機制為：在類風濕關節炎患者腸道炎性反應的發生發展中，腸道菌群失調使細菌毒素無序分泌，造成CRP、ESR、IL-6、IL-8等炎性因子水平顯著上升進而出現炎性反應級聯增長，腸道內皮細胞損傷加重、腸道通透性增加，患者體液免疫異常增加，免疫指標IgA、IgE、IgM、IgG水平升高。然而本研究為單中心的小樣本研究，研究的菌群種類有限，且可能會存在不同類風濕關節炎患者個體間差異較大的情況，因此后續將增大樣本量進一步考證和研究。

與健康人群相比，類風濕關節炎患者腸道乳桿菌、雙歧桿菌數量顯著降低，腸球菌、真桿菌數量顯著增加，物種豐富度和多樣性相對較低。類風濕關節炎患者腸道菌群與炎性指標、免疫指標水平顯著相關，早期改善腸道菌群紊亂可能有利于降低RA發病率。臨床靶向調節腸道菌群失調可能對治療類風濕關節炎有關鍵作用，有可能成為傳統方法的補充，但其具體臨床作用有待進一步探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

蔣磊：負責研究方案的設計，論文審核；方興剛：負責提出思路、文章撰寫；蘭培敏：負責理資料收集、統計學分析；陳漢玉：負責資料整理、論文修改