大葉冬青質量控制方法的研究進展

陳穎，王存琴，方蘭婷，姜新秀

(1.安徽省多糖藥物工程技術研究中心，安徽 蕪湖 241002；2.活性生物大分子研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241002；3.安徽省皖南植物藥活性物質篩選與再評價工程實驗室，安徽 蕪湖 241002；4.皖南醫學院藥學院，安徽 蕪湖 241002)

大葉冬青(IlexlatifoliaThunb.)為冬青科(Aqulfoliaceae)冬青屬(Ilex)常綠喬木，多見于平原地區的灌木叢中，在浙江、江蘇、安徽及福建等地均有分布[1]。具有清熱解毒、消煩止渴、止痛的功效，常用于治療咽喉痛、感冒發熱、眼熱和痢疾等癥[2]，其主要包含三萜及其皂苷、黃酮和多酚類等化學成分[3-6]。其藥理活性研究結果表明大葉冬青具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎等作用[7-9]。在化學成分與藥理作用方面的研究成果顯示大葉冬青具有臨床藥用與資源開發的重要價值。目前關于大葉冬青化學成分含量測定方面的研究漸漸趨于成熟，但在中國藥典中還未建立大葉冬青的質量標準。為了進一步完善大葉冬青的質量控制，對近年來大葉冬青化學成分的分析方法進行了總結，以期為大葉冬青的化學成分研究和含量測定提供幫助。

1 高效液相色譜(HPLC)法

近代HPLC發展和普及速度飛快，儀器愈發先進，已經成為藥企、醫院、高校和研究所等單位的必備大型儀器。因其具有檢測便捷，樣品用量小，分析速度快等優點，已成為臨床藥物實驗、醫學檢測化驗、高校中藥檢測、環境衛生檢測等分析領域最常用的分離分析技術。

1.1 三萜類成分

三萜類成分主要有五環三萜和四環三萜兩大結構特征，在植物中，常以游離形式存在或與糖結合合成苷類或酯類，具有明顯的結構特征，因其各官能團不同，表現出多種顯著的生物活性[10]，是大葉冬青定性或定量的主要指標成分。

王存琴等[11]采集了22批不同批次的大葉冬青葉，選用高效液相色譜法檢測冬青葉中六種三萜類化合物的含量，在色譜條件中選用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，檢測波長設為205 nm，流動相采用乙腈-0.4%磷酸水溶液不同比例洗脫，同時對22批藥材進行指紋圖譜分析。色譜圖結果顯示27-p-Coumaroyloxy ursolic acid、3β-Hydroxyurs-11-en-28，13β-olide、烏發醇等6種三萜類成分具有良好的分離性，不同批次大葉冬青中6種三萜類成分含量存在顯著差異。14批同源樣品指紋圖譜相似度較高，均大于0.9，結果一致性較好。 10批不同來源的樣品指紋圖譜相似度較低。所建立的方法具有良好的穩定性和重復性，可為有效控制大葉冬青藥材的質量提供依據。

熊果酸和齊墩果酸是極性相似的同分異構體，這使得分離更加困難。楊新河等[12]使用Betasil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，流動相選用乙腈-水(95∶5)，紫外檢測波長設置為210 nm，可以很好的分離、測定苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸的含量。黃浩等[13]使用 Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，甲醇-0.03%磷酸(90∶10)為流動相，檢測波長設置為215 nm，也可以很好的分離不同品種苦丁茶中的熊果酸和齊墩果酸。顧學方等[14]也采用HPLC法在色譜圖上使不同品種苦丁茶中的熊果酸及齊墩果酸分離度大于1.5，同時采用外標法進行含量測定，其色譜條件是選擇了Agilent HC- C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱，洗脫溶劑選用甲醇和磷酸水，檢測波長設為215 nm。三種方法均能很好的分離檢測苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸，且含量測定結果分析發現冬青科冬青屬的苦丁茶、大葉冬青質量較好，隨著隨貯存時間延長，化學成分含量可能會有所下降，綜合以上方法，可以應對各個品種苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸的含量測定，為進一步控制大葉冬青的質量提供方法依據。

汪雷等[15]采用HPLC法分析了26批來自不同地方及不同采收時間的大葉冬青葉中中α-香樹脂素、羽扇豆醇、豆甾醇、和苦丁冬青苷 D 4種三萜類化合物的含量。其在色譜方法中選擇了YMC-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)為流動相等比例洗脫，檢測波長定為205 nm。26批藥材中4種三萜類成分含量差異顯著，與采集月份密切相關，建立的方法準確可行，重現性好。

1.2 三萜皂苷類成分

三萜皂苷是三萜苷元與糖結合成苷，其水溶液振搖能產生肥皂樣泡沫。來源于多種中草藥植物中，如人參、桔梗、甘草、酸棗仁等[16-17]，具有調節生理代謝、增強免疫系統功能、化痰、降低膽固醇、抗動脈粥樣硬化、降低血壓等作用[18-19]。關玥等[20]在大葉冬青化學成分研究的基礎上，采用HPLC法測定了大葉冬青中大葉冬青皂苷F、大葉冬青皂苷C、苦丁冬青皂苷F等6種三萜皂苷的含量。在HPLC色譜條件中選擇了Wonda Cract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相選用乙腈和水不同比例洗脫，檢測波長設置為210 nm。含量測定結果表明大葉冬青中三萜皂苷的含量在不同產地排序從高到低分別為浙江、江西和安徽。該方法可以同期檢測大葉冬青中6種三萜皂苷成分的含量，能快速綜合的評價大葉冬青藥材質量，促進大葉冬青和苦丁茶藥材質量控制的提升。楊滔[21]等采用采用高效液相色譜法測定苦丁茶7種三萜皂苷的含量，即大葉冬青苷G、苦丁冬青苷A、大葉冬青苷H和苦丁冬青苷G等。色譜條件中的色譜柱是YMC pack ODS-A(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相是乙腈和水不同比例洗脫，在210 nm處設置紫外檢測波長。高效液相色譜圖可以看出在此條件下7種三萜皂苷分離度良好，旁邊無明顯干擾成分，從含量測定結果中得出，大葉冬青中三萜皂苷總量在廣東和廣西兩個地域相差不大。方法簡便、重復性好、準確度高，可作為苦丁茶藥材質量控制標準。張俊清等[22]采用高效液相色譜法，色譜條件選用Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5μm)色譜柱，流動相選用乙腈-水(36∶64)，在紫外228 nm處設置苦丁苷A的檢測波長，在紫外261 nm處設置苦丁苷D的檢測波長，測定海南大葉冬青葉中苦丁苷A和D的含量，結果表明，大葉冬青中苦丁苷A和D的含量較高，推測其可以作為大葉冬青質量控制的指標成分。倪帥帥等[23]利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-蒸發光檢測器(HPLC-DAD-ELSD)法對綜合分析苦丁茶的指紋圖譜，確定苦丁茶黃酮和皂苷的分布特征。指紋圖譜分析結果表明10批苦丁茶的指紋圖譜相似度均大于0.90，表明該指紋圖譜方法具有良好的準確性和重復性，重復性佳，可促進苦丁茶冬青藥材的質量控制的發展。對苦丁茶HPLC-DAD和HPLC-ELSD指紋圖譜的比較分析表明，苦丁茶中黃酮類化合物的含量遠低于苦丁茶皂苷類化合物的含量。

1.3 黃酮及多酚類成分

多酚物質的種類復雜，主結構特征明顯，按結構大致可分為類黃酮、芪、酚酸和木脂素。黃酮類化合物的基本母核是2-苯基生色酮結構，特征突出，但種類頗多，主要以游離形式存在于中草藥中。具有抗氧化、強化血管壁、抗動脈粥樣硬化和降血脂等作用[24-25]。王存琴等[26]采用HPLC法同時檢測大葉冬青葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸等10種多酚類化學成分，分析從不同產區和不同收獲期采集大葉冬青葉中10種多酚類成分的含量是否存在差異，同時還選用體外抗氧化化學方法DPPH法評估其抗氧化活性。從含量測定結果分析得出大葉冬青葉中多酚類成分的總含量豐富，適合秋冬采收。從方法學實驗考察結果得出，該方法重復性好，方便快速，準確度高，可為制定大葉冬青的質量標準提供科學依據。尹禮國[27]采用HPLC法檢測2種川產苦丁茶中蘆丁的含量，其中女貞子的芽葉和老葉分別為(0.118±0.011)%，(0.083±0.012)%，粗壯女貞的芽葉、老葉(0.082±0.012)%，(0.065±0.008)%。田建平[28]等選擇超聲提取藥材中的綠原酸，采用RP-HPLC法檢測6種冬青屬苦丁茶中綠原酸的含量，其中苦丁茶采自不同的生長階段、不同時期、不同區域等。對所有批次苦丁茶中綠原酸的含量分析結果顯示苦丁茶冬青、霍山冬青、大葉冬青中綠原酸含量較高，野生苦丁茶冬青老葉中綠原酸含量較高，其含量隨貯存時間延長有所下降。Yi H等[29]首次建立了一測多評多定量分析(QAMS)方法，采用HPLC法同時測定苦丁茶中18種活性成分。以蘆丁、異綠原酸 A 和苦丁苷A作為內標物質，結果表明，在不同的色譜條件下，各化合物的相對校正因子具有良好的重現性。

1.4 其他成分

馬應丹等[30]首先提取純化了苦丁茶的總嘌呤堿，然后通過HPLC分離和測定嘌呤堿。 結果表明，這種苦丁茶不僅含有咖啡因、茶堿和可可堿，還含有苦丁茶特有的嘌呤堿成分苦丁堿。李宏楊[31]首次采用HPLC法測定建苦丁茶冬青中白樺酯酸的含量，分析條件為C18反相柱，流動相選用甲醇-0.2%磷酸水溶液為84∶16，檢測波長設置為210 nm，含量測定結果顯示白樺酯酸的平均含量為0.28%，分析方法快速可靠，為大葉冬青的質量控制方法的建立提供了基礎資料。

2 其他方法

Zhou J等[32]建立了超高效液相色譜四極桿飛行時間串聯質譜法(UPLC-qTOF-MS/MS)，快速分離鑒定苦丁茶中的化學成分。通過UPLC-qTOF-MS/MS對苦丁茶進行色譜分析，鑒定出53種化合物，其中確定已知化合物18種。總體數據結果顯示苦丁茶的主要成分是酚酸和三萜。該方法簡潔有效，為接下來苦丁茶的全面質量控制研究提供了一種潛在的方法。

馮琳琳等[33]首次在一測多評法(QAMS)的基礎上采用液相色譜-質譜聯用技術同時檢測苦丁茶冬青中山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、苦丁冬青皂苷 C、苦丁冬青皂苷 E和苦丁冬青皂苷 D等 6種成分的含量。選擇含量較高且穩定的苦丁冬青皂苷C為內標物，測定和計算其它5種成分的相對校正因子，然后利用計算出的相對校正因子推算其它5種成分的含量。同時也用外標法(ESM)計算出6種化學成分的含量，將QAMS與ESM計算出的含量進行對比分析，分析結果提示兩者無明顯差別。說明QAMS測定苦丁茶冬青中6種成分的方法快速準確，且節約標準品，是苦丁茶冬青質量控制的優選方法。

Fan C等[34]建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用(UPLC-QTOF-MS)多組分測定與指紋圖譜分析相結合的方法，用于大葉冬青葉的質量評價與控制。該方法具有快速、高效、準確的優點，可在13 min內完成一次色譜多組分測定和指紋圖譜分析。實驗結果表明，采用UPLC-QTOF-MS技術的多成分測定和指紋圖譜分析相結合的策略是一種有效的快速分析藥物的方法，在產地鑒別、真偽鑒定和藥物質量控制等方面具有廣闊的前景。曠春桃等[35]采用氯化鋁法和硝酸鋁-亞硝酸鈉法兩種化學方法測定大葉冬青葉中的總黃酮含量。2種方法在實驗過程各環節及原理對比表明氯化鋁法在大葉冬青葉提取液中總黃酮的含量測定穩定性與可靠性優于硝酸鋁-亞硝酸鈉法。王新等[36]以傳統方法水提醇沉法提取苦丁茶冬青葉多糖，為得到較好的顯色條件，選用了正交實驗優化顯色條件。多糖的含量測定選用了經典方法苯酚-硫酸法。此法為大葉冬青葉多糖成分的進一步研究開發與應用提供了參考依據。熊波等[37]結合乙醚超聲萃取和水蒸氣蒸餾兩種傳統實驗方法提取苦丁茶冬青中的揮發油，然后用氣相色譜-質譜聯用法鑒定出揮發油中的57個成分，鑒定結果表明揮發油中主要是醇、醛、酮、醚、脂肪酸、脂肪酸酯及含氧萜類等化合物。

3 討論

綜上所述，大葉冬青物產豐富，具有多樣的化學結構，其主要的含量測定與質量控制的分析方法是HPLC法。HPLC法因其簡單易懂，且操作方便，深受研究者青睞，但其對化學成分含量要求較高，靈敏度次于UPLC和液質聯用技術等。而目前采用UPLC、LC-MS方法研究大葉冬青化學成分含量的文章較少，這和儀器本身價格昂貴、操作較為復雜，原理理解有難度等因素有關。主要總結了大葉冬青含量測定與質量控制的相關文章，為后續大葉冬青的化學成分研究和質量標準的建立提供一些幫助和理論依據，促進其化學成分的提取與開發利用。