p53/CytC/Apaf-1介導線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中的作用

張彐寧 靳曉飛 高維娟

(河北中醫學院 河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

腦卒中的發病類型主要包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中的發病率高于出血性腦卒中，占腦卒中總數的70%～80%〔1〕。缺血性腦卒中的發病機制較為復雜，主要與能量代謝障礙、活性氧增多、鈣超載、炎性反應、細胞凋亡、自噬、高能磷酸化合物生成障礙、興奮性氨基酸毒性作用等多種內外因素相關〔2〕。各因素之間互相作用，最終導致了神經功能破壞、腦梗死灶的形成。研究發現，線粒體功能異常是缺血性腦卒中病理進程中的關鍵一環。線粒體功能異常，可引起促凋亡相關因子表達增強，激活線粒體凋亡通路，引起缺血性腦卒中神經功能障礙〔3〕。本文就p53/細胞色素(Cyt)C/凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)-1介導的線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中的作用進行綜述。

1 線粒體凋亡通路與缺血性腦卒中

1.1細胞凋亡的概念 1842年，德國科學家Carl Vogt首先對凋亡進行了描述。1885年，解剖學家Walther Flemming做出了程序性細胞死亡的精準描述。直到1965年，細胞凋亡才被學術界重新重視，當時利用電鏡技術，明確地區分凋亡細胞與創傷性死亡的細胞。1972年病理學家Kerr等將自然細胞死亡過程定義為凋亡。凋亡是指在體內外因素的誘導下，由嚴格和復雜的信號網絡調控而發生的自主性細胞有序死亡過程〔4〕，細胞凋亡主要表現為細胞縮小、細胞質膜泡狀化、核固縮、DNA裂解為片段，最后胞膜下陷分割包裹胞質及細胞器，最終形成凋亡小體，被周圍的巨噬細胞所吞噬，從而維持生物體的正常代謝過程和內環境的穩定。

1.2線粒體凋亡通路的發生過程 線粒體凋亡通路是一種典型的caspase依賴性的程序性細胞死亡方式，線粒體作為一個儲存器，它儲存了較多的促凋亡蛋白如CytC、凋亡誘導因子(AIF)、核酸內切酶G及caspases-2，3，8，9酶原等〔5〕，當細胞受到內部凋亡誘導因素及p53等外部凋亡誘導因素刺激時，引起線粒體自身應激反應，導致線粒體膜通透轉換孔(PTP)開放，CytC等促凋亡蛋白由線粒體膜間隙釋放入胞質，在dATP存在的情況下立即與Apaf-1結合，使Apaf-1暴露自身的caspase募集結構域(CARD)，同時與Procaspase-9的CARD結構域結合形成凋亡酶體復合物，即凋亡小體，進而激活caspase-9，引起caspase連鎖反應，導致caspase-3，caspase-6，caspase-7等下游凋亡蛋白逐一被激活，成為細胞凋亡的執行者，進而激活和裂解核酸內切酶、核纖層蛋白酶等的作用底物，最終降解細胞骨架，致細胞凋亡〔6〕。

1.3線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中的作用 線粒體是真核生物進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，以ATP形式為機體提供大部分能量，是整個機體的發電廠〔7〕。腦是對缺血缺氧最敏感、耐受能力最差的器官，由于興奮性神經遞質的傳遞，大腦具有高能量需求，而大腦的能量儲備低，主要依賴于葡萄糖的有氧氧化，高ATP轉換又使大腦易受缺血性損傷的影響〔8〕。當缺血性腦卒中發生時，線粒體受損，能量合成障礙，腦組織ATP迅速減少，位于細胞膜的離子泵功能障礙，導致細胞水腫，線粒體腫脹，使受損線粒體釋放出許多的促凋亡物質，從而激活線粒體凋亡通路，引起caspase級聯反應，最終降解細胞內蛋白質，導致細胞的死亡。

Li等〔9〕從出生1～2 d的SD大鼠幼仔中分離提取原代神經元，建立氧糖剝奪(OGD)模型，模擬了缺血性腦卒中神經元損傷環境，在細胞水平，觀察了線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中神經元凋亡的影響。結果發現，模型組神經元活性顯著降低，CytC與caspase-3蛋白表達明顯升高，TUNEL染色陽性細胞數量顯著增多，神經元出現明顯的凋亡現象，表明在缺血性腦卒中的病理進程中激活了線粒體凋亡通路。Bao等〔10〕采用OGD誘導的RGC-5細胞損傷模型，模擬缺血性腦卒中損傷環境，應用CCK-8，流式細胞術和Western印跡對OGD誘導的RGC-5細胞損傷進行研究。結果發現，模型組線粒體凋亡通路相關因子p53，Bax，cleaved-caspase-3/-9表達均顯著增高。表明線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中發病過程中發揮了重要作用。Xie等〔11〕通過建立SD大鼠腦缺血再灌注損傷模型，采用在體實驗模擬缺血性腦卒中神經元損傷環境，觀察了p53介導的Bax/CytC/caspase-3線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中大鼠中的作用。研究發現，模型組大鼠腦梗死體積較大并伴有嚴重腦水腫，Nissl、TUNEL染色陽性細胞數量增多，線粒體凋亡通路相關蛋白Bax、CytC、caspase-3表達顯著增高。以上研究都表明了缺血性腦卒中后明顯激活了線粒體凋亡通路，引起了缺血區域腦組織神經元凋亡的發生。

2 p53/CytC/Apaf-1與線粒體凋亡通路

線粒體凋亡通路是caspase依賴性的重要細胞凋亡機制，以線粒體為靶的蛋白分子以不同的途徑影響線粒體的功能，使細胞最終凋亡。它們有的在線粒體膜上形成孔道致使線粒體腫脹；有的增加線粒體膜的通透性，使凋亡效應因子從線粒體漏出；有的通過降低線粒體膜電位使其通透性增加，進而誘導凋亡。而p53/CytC/Apaf-1線粒體凋亡通路就是通過增加線粒體膜的通透性，從而誘導細胞凋亡發生。

2.1p53的結構與作用 p53是一種腫瘤抑制基因，由16～20 kb組成，是一個由393個氨基酸組成的含磷蛋白，相對分子質量約53，簡稱p53。p53是目前公認的促凋亡基因，在細胞凋亡過程中發揮了重要作用。p53可通過上調促凋亡蛋白Bax、Puma、Noxa、Bid、PTEN、Fas/CD95，下調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl，來誘導細胞凋亡的發生；也可直接在細胞質膜聚集激活促凋亡蛋白Bax而觸發細胞凋亡；還可以和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl 形成復合物直接誘導線粒體外膜通透性增加，導致CytC釋放〔12〕，激活caspase級聯反應，引起細胞凋亡的發生。

p53在缺血性腦卒中引發神經細胞凋亡過程中發揮了重要作用，它是抑制神經細胞凋亡的關鍵靶點〔13，14〕。大腦缺血缺氧均可促進p53表達，通過多種形式引起促凋亡蛋白Bax表達增多，抑凋亡蛋白Bcl-2表達下降，進而激活caspase級聯反應，促使神經細胞凋亡〔15〕。Young Park等〔16〕應用SH-SY5Y細胞，建立缺氧缺糖/復氧復糖(OGD/R)模型，模擬缺血性腦卒中神經元損傷環境，探討金納米顆粒對缺血性腦卒中的神經保護作用。研究發現，給予OGD/R處理后，模型組細胞p53、Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9等凋亡相關蛋白的表達明顯升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降，當給予金納米顆粒治療后，p53、Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9等凋亡相關蛋白的表達明顯下降，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著提高，并且SH-SY5Y細胞活性明顯升高，有效發揮了神經保護作用，表明p53介導的線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中病理進程中扮演著重要角色。

2.2CytC的結構與作用 CytC是分子量為13 kD左右的核編碼蛋白，由105個氨基酸組成，是水溶性線粒體膜蛋白。生理狀態下，CytC存在于線粒體的內膜外側，無法穿過線粒體外膜釋放至胞質，當細胞受到凋亡信號因子刺激后，CytC在唯BH3結構域蛋白輔助下易位到線粒體膜上，經線粒體膜通透轉換孔進入細胞質，在dATP存在的條件下，與胞質中的Apaf-1蛋白相結合，誘導caspase-9活化，引起細胞凋亡〔17〕。研究發現，CytC從線粒體釋放到細胞質是多種細胞凋亡方式的共同表現，它是線粒體凋亡通路中不可缺少的重要因子〔18〕。

當細胞受到缺血、缺氧等外界條件刺激時，促凋亡因子將通過破壞線粒體外膜，促使活性氧、自由基等信號因子刺激線粒體內膜小孔開放，使細胞自身發生應激性改變，水和溶質等小分子物質進入線粒體基質，導致線粒體膨脹，內膜的膨脹導致外膜的破裂，破壞了線粒體膜完整性，使包括CytC在內的多種凋亡蛋白釋放入胞質〔19〕，最終引發細胞程序性死亡。Zhao等〔20〕應用小鼠海馬神經元OGD和小鼠全腦缺血性損傷模型，在細胞和動物水平，分別探討了Ngn2對缺血性腦卒中的神經保護作用。結果發現，給予OGD和全腦缺血處理后，模型組CytC的釋放明顯增多，Bax、caspase-3等促凋亡蛋白的表達明顯增多，給予Ngn2處理后，CytC的釋放顯著減少，Bax、caspase-3等促凋亡蛋白的表達顯著降低，有效減輕了OGD誘導的小鼠海馬神經元損傷和腦缺血小鼠腦梗死體積，表明CytC介導的線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中病理進程中發揮了重要作用。

2.3Apaf-1的結構與作用 Apaf-1是一種分子量為130 kD的胞質蛋白，存在于細胞質中，包含1 194個氨基酸殘基。按照自身結構的不同Apaf-1分為3種結構域：CARD結構域、CED-4同源結構域、WD-40結構域。當CytC和dATP存在的條件下，Apaf-l構象發生改變，WD-40結構域移位，暴露其CARD結構域，通過CARD-CARD親和作用與Procaspase-9的CARD結構域相結合，誘導caspase-9的活化，從而啟動caspase級聯反應〔21，22〕。

Apaf-1作為線粒體介導細胞凋亡通路中的重要因子與神經元凋亡密切相關，它是形成凋亡體的核心，在激活caspase級聯反應中起樞紐作用〔23，24〕。Vaibhav等〔25〕通過建立腦缺血再灌注損傷模型，模擬缺血性腦卒中損傷環境，探討了姜油酮對腦缺血再灌注損傷大鼠神經保護作用。模型組大鼠腦梗死體積明顯增加，線粒體損傷顯著，促凋亡蛋白Apaf-1、Bax、caspase-3、caspase-9表達明顯升高。給予姜油酮處理后，促凋亡蛋白Apaf-1、Bax、caspase-3、caspase-9表達顯著降低，大鼠腦梗死體積明顯減小，研究表明，表明了Apaf-1介導線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中病理進程中發揮了重要作用。

2.4p53/CytC/Apaf-1介導線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中的作用 p53被認為是細胞凋亡連鎖反應中的第一個關鍵因素，在調節缺血缺氧引起的細胞損傷時發揮著關鍵作用〔13,26〕。當缺血性腦卒中發生后，線粒體功能障礙，此時，p53則在細胞質膜發生聚集，激活了多結構域促凋亡蛋白Bax〔27〕，使得Bax與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，從而介導CytC的釋放，p53也可以直接作用于線粒體膜，誘導CytC釋放入胞質，與胞質中的Apaf-1結合，從而激活下游凋亡蛋白caspase-9/-3，引起caspase的級聯反應〔18〕，最終誘導細胞凋亡。

Gao等〔28〕應用轉基因小鼠靶向抑制Apaf-1的表達，初步觀察了抑制Apaf-1介導的線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中小鼠的神經保護作用。研究發現，利用轉基因小鼠靶向抑制Apaf-1，顯著降低了胞質中CytC的表達，抑制了凋亡蛋白caspase-9/-3活化，有效改善了缺血性腦卒中小鼠神經功能障礙。Xie等〔11〕采用大鼠腦缺血再灌注損傷模型，模擬缺血性腦卒中腦損傷環境，并注射p53抑制劑(PFT-α)，觀察了p53/CytC/Apaf-1線粒體凋亡通路，在缺血性腦卒中大鼠神經損傷中的作用。研究發現，模型組大鼠腦梗死體積明顯增大，p53、Bax、CytC、caspase-3的蛋白表達量明顯提高，給予p53抑制劑后，p53、Bax、CytC、caspase-3的蛋白表達量明顯降低，大鼠腦梗死體積明顯減小，表明了抑制p53/CytC/Apaf-1線粒體凋亡通路的激活，對腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，給缺血性腦卒中的治療具有重要意義。Wen等〔29〕利用SD大鼠建立腦缺血再灌注損傷模型，模擬缺血性腦卒中損傷環境，觀察了缺血性腦卒中大鼠腦梗死體積、神經細胞凋亡率及p53、Bax、Bcl-2、CytC和caspase-3的蛋白表達，探討了NDRG4基因在調節細胞凋亡和預防腦缺血再灌注損傷中的新作用，研究發現， NDRG4基因可以抑制p53的表達和活性，從而降低神經細胞凋亡率，減少腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，降低p53、Bax、Bcl-2、CytC和caspase-3的蛋白表達。此外，Kotipatruni等〔30〕研究發現，NDRG4基因的下調可以激活p53，增加Bax的表達及轉運至線粒體膜，促使CytC釋放，從而活化線粒體凋亡通路，導致細胞凋亡的發生。這些都提示了p53/CytC/Apaf-1介導的線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中病理進程中扮演了重要角色。如果能夠有效抑制p53/CytC/Apaf-1介導的線粒體凋亡通路，將對缺血性腦卒中的治療提供重大幫助。

3 小結與展望

缺血性腦卒中是一種臨床上常見腦血管疾病，尤其高發于60歲以上老年人。缺血性腦卒中發生后，可引起線粒體功能障礙，導致線粒體腫脹，線粒體膜通透性增加，促凋亡相關因子表達增強，引發線粒體途徑細胞凋亡。線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中發生后被激活，在腦缺血區域引起細胞凋亡的級聯反應，破壞神經元功能，造成嚴重的腦組織損傷。p53/CytC/Apaf-1是線粒體凋亡通路中的經典途徑，在缺血性腦卒中神經細胞凋亡過程中發揮著重要作用。p53是一種特異性的轉錄因子，作為凋亡發生的起始因素，可誘導多種促凋亡蛋白轉移至線粒體膜，使其通過線粒體膜通道轉換孔進入細胞質，凋亡相關因子CytC就是其中一種促凋亡因子，它是線粒體凋亡通路中的關鍵一環，其進入胞質后，與凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1的羧基端結合，使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-CytC-Procaspase-9多聚復合體，進而激活caspase級聯反應，引發腦缺血區域神經細胞凋亡的發生。而抑制p53/CytC/Apaf-1介導的線粒體凋亡通路，可有效減輕腦缺血損傷，對于防治缺血性腦卒中具有重要意義。