MACC1基因下調對胃腺癌細胞的生長抑制作用

羅毅，劉路培，于路

MACC1基因下調對胃腺癌細胞的生長抑制作用

羅毅，劉路培，于路

目的研究下調MACC1表達對胃腺癌細胞株MGC-803生長作用的影響。方法設計并合成RNAi干擾片段，脂質體介導MACC1-siRNA1（MACC1-siRNA1組）和MACC1-siRNA2（MACC1-siRNA2組）轉染MGC-803細胞，同時設非特異性干擾片段為對照組。應用qRT-PCR檢測轉染后各組MACC1的mRNA表達，噻唑藍比色實驗、平板克隆形成實驗和流式細胞周期實驗檢測RNAi轉染后MGC-803細胞增殖能力的變化，Western blot檢測轉染后MACC1、P21、CDK4、CCND1和c-myc蛋白的表達，并進行比較分析。結果與對照組相比，MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組MACC1表達在mRNA及蛋白水平下降，細胞的增殖速度變慢，單克隆形成數量減少，細胞周期中G1期細胞的比例顯著升高，P21的表達增加，MACC1、CDK4、CCND1和c-myc的表達減少。結論下調MACC1能使MGC-803細胞的細胞周期進程受阻，抑制細胞的增殖，MACC1可以作為治療胃癌的有效靶點。

胃腫瘤；腺癌；細胞增殖；細胞周期；RNA干擾；MACC1基因；MGC-803細胞

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤，外科手術是其主要的治療手段，術后輔以藥物化療或放療等。雖然經過正規和系統治療，但效果并不滿意，僅有30%～50%的患者得到根治性切除，大多數患者死于局部進展、早期轉移或復發［1］。MACC1是近年來研究較多的一個基因，有研究顯示MACC1在胃癌中過表達，并且與胃癌的病理分期和預后具有密切的聯系，可作為預測胃癌轉移以及預后的指標［2-3］。雖然目前國內外已經有大量的關于MACC1基因與胃癌轉移相關的研究，但是與胃癌生長調控作用方面的研究甚少。本研究旨在觀察MACC1對MGC-803細胞的生長調控作用，探究其在胃癌發生、發展過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料MGC-803細胞株購自中國科學院細胞庫；RPMI 1640培養基、胎牛血清購自Hyclone公司；逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒為TaKaRa公司產品；二甲基四氮唑藍（MTT）、碘化丙啶（PI）和二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產品；Lipofectamine2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；PMSF及RIPA蛋白裂解液為碧云天公司產品；MACC1、P21、CDK4、CCND1和c-myc單克隆抗體購自Epitomics公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國Milli?pore公司；增強型化學發光檢測試劑盒（ECL）、β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自北京康為世紀公司；凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司產品；Mx3000PTM Real Time PCR儀為Stratagene公司產品；倒置相差顯微鏡為Olympus公司產品。

1.2 方法

1.2.1 瞬時轉染設計及合成針對MACC1基因的siRNA干擾片段。MACC1-siRNA1組：5′-GCCACACATGCTTAAC?CATGA-3′；MACC1-siRNA2組：5′-GGAAGCAGGTGAAG?TAGTTCA-3′。轉染前24 h接種MGC-803細胞于直徑60 mm皿中，在細胞密度達50%～70%匯合度時，將培基換成無血清培基。將稀釋好的干擾片段與LipofectamineTM2000脂質體輕柔混勻，室溫孵育20 min，形成轉染復合物；然后將上述混合物加到細胞培養基中，輕輕混勻，在5%CO2、37℃培養箱中培養，6～8 h后更換完全培養基。48 h后檢測干擾效率。以非特異性干擾片段（Negative control，5′-GCCAGCT?TAGCACTGACTC-3′，不針對任何已知人mRNA）為對照組。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測干擾效率轉染48 h后收集各組細胞，TRIzol法提取RNA，檢測RNA濃度和純度后，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，然后按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明進行Real-Time PCR檢測，以βactin為內參。MACC1引物：上游5′-GGCTGTGATGCTAC?GAGATA-3′，下游5′-ACACCAGGACAATGCCTACT-3′；βactin引物上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA-3′。總反應體系20 μL，反應條件：94℃預變性30 s；94℃10 s，55℃10 s，72℃8 s，40個循環；95℃1 min，55℃30 s，95℃30 s，繪制熔解曲線。各組均設復孔3個，實驗重復3次。結果判定采用2-ΔΔCT法：△CT= CT目的基因-CT內參，△△CT=△CT處理組-△CT對照組，處理組的相對表達值=2-△△CT，對照組的相對表達量=1。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖取MACC1-siRNA1，MACC1-siRNA2和對照組細胞，轉染后24 h，將細胞消化下來，以每孔4×103個細胞接種于96孔板中，每孔體積200 μL，每組5個復孔，同時設空白對照（僅加培養基），分別培養1、2、3、4和5 d，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，37℃繼續培養4 h后棄掉孔內培養基，加入DMSO 150 μL，室溫孵育10 min，微振蕩器振蕩10 min，使結晶物充分溶解，以空白對照孔調零，酶標儀上490 nm測定各孔光密度（OD）值，以相對應OD比值表示細胞增殖能力大小。各組取5個孔平均值，重復3次，繪制生長曲線。

1.2.4 平板克隆實驗取MACC1-siRNA1，MACC1-siRNA2和對照組細胞，轉染后24 h，0.25%胰酶消化制成細胞懸液，細胞板計數，接種200個細胞到6孔培養板中，每種細胞接種2孔，輕輕晃動培養板，使細胞分散均勻，37℃、5%CO2培養箱中培養2周。出現肉眼可見的細胞克隆，甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥；用Giemsa應用染液染色5 min，流水緩慢洗去染液，空氣干燥后顯微鏡下計數形成的克隆數（≥50個細胞為1個克隆）。實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞周期收取MACC1-siRNA1、MACC1-siRNA2和對照組細胞，轉染后48 h，消化細胞制成細胞懸液，各組細胞密度約為1×106個/mL，用預冷PBS洗滌細胞2次，加入預冷70%乙醇混勻，4℃固定過夜，用冷PBS離心洗滌1次，加入400 μL PBS，RNase A至終濃度0.5 g/L，碘化丙啶（PI，10 mg/L）染色20～30 min；避光放置15 min，上機檢測。全部數據經FACSCalibur流式細胞儀和CELLQuest軟件獲取。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達轉染72 h后收集MACC1-siRNA1、MACC1-siRNA2和對照組細胞，用細胞裂解液提取待測細胞的總蛋白，BCA法進行蛋白定量，配制10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠，每孔加入等量待測蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠恒壓80 V 30 min，分離膠恒壓100 V 90 min。采用濕轉法進行轉膜，根據蛋白Marker所指示的條帶位置，將目的蛋白所在范圍的膜裁剪下來，同時裁剪β-actin蛋白條帶作為內參照。含5%BSA的TBST封閉液室溫孵育1 h。用封閉液稀釋一抗，MACC1、P21、CDK4、CCND1和c-myc兔抗人單克隆抗體（1∶500稀釋）和β-actin鼠抗人單克隆抗體（1∶1 000稀釋），室溫孵育2 h，4℃孵育過夜。次日取出膜，室溫下TBST洗膜；用辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔、抗鼠二抗（1∶1 000稀釋），室溫孵育1 h，TBST洗膜。按照ECL檢測試劑盒說明書進行檢測，凝膠成像系統檢測蛋白條帶的表達情況。

1.3 統計學方法采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR結果對照組、MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組細胞MACC1相對表達量分別為1.003±0.085、0.117±0.012和0.098±0.008，差異有統計學意義（F=116.02，P＜0.001）。

2.2 MTT結果與對照組細胞相比，沉默MACC1后的MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組細胞增殖速度明顯減慢，見圖1。

Fig.1Cell growth curves of all three groups圖1 各組細胞的生長曲線

2.3 平板克隆結果各組細胞均能形成克隆菌落，對照組、MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組克隆數分別為106.64±12.22、48.50±10.13和32.62± 6.09，差異有統計學意義（F=42.57，P＜0.01），與對照組相比，MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組形成的克隆數明顯減少（均P＜0.05），見圖2。

Fig.2Colony formation ability of all three groups圖2 各組細胞平板克隆形成實驗

Fig.3Cell cycles of negative control，MACC1-siRNA1 and MACC1-siRNA2 detected by flow cytometry圖3 流式細胞術檢測3組細胞周期分布

2.4 細胞周期結果與對照組處于G1期細胞百分率（45.36±1.21）%相比，MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組的G1期細胞百分率分別為（60.34±1.81）%和（61.25±1.36）%，G1期百分率顯著增高，差異有統計學意義（F=108.70，P＜0.001），見圖3。

2.5 Western blot檢測蛋白表達量結果與對照組相比，MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組MGC-803細胞中MACC1、CDK4、CCND1和c-myc表達量減少，P21表達量增加，見圖4。

Fig.4Protein expression of MACC1，CDK4，CCND1，c-myc and P21 after MACC1 silencing detected by Western blot analysis圖4 Western blot檢測轉染后MACC1、CDK4、CCND1、c-myc和P21的表達

3 討論

MACC1是由Stein等［4-5］通過差異顯示聚合酶鏈反應技術在結腸癌中獲得的調控結腸癌生長和轉移的新基因，定位于人類7號染色體（7p21.1），含有7個外顯子和6個內含子，其cDNA含2 559個核苷酸序列，編碼由852個氨基酸殘基組成的蛋白質，MACC1明顯增加了腸癌細胞的增殖、侵犯及擴散，在小鼠模型中，腫瘤細胞的生長和轉移能力亦明顯增強。在肺癌［6］、肝癌［7］、胰腺癌［8］、卵巢癌［9］、乳腺癌［10］等惡性腫瘤中也發現，MACC1可影響癌癥患者的預后或術后復發，可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。Zhang等［11］發現，MACC1在卵巢癌組織中高表達，MACC1基因沉默后，卵巢癌細胞的增殖、轉移及侵襲能力明顯降低；尚超等［12］通過qRT-PCR技術檢測腎癌組織發現已發生轉移的患者癌組織中MACC1的表達量為未轉移癌組織中的2.45倍，抑制腎癌細胞Caki-1的MACC1的表達后，細胞的侵襲能力明顯下降；Muendlein等［13］另外研究發現MACC1的表達與原發灶、淋巴結轉移、遠處轉移顯著相關，提示MACC1可作為乳腺癌患者生存預后的指標，其表達狀態可用來評估新型抗乳腺癌治療的有效性。Wang等［14-15］采用免疫組化技術檢測97例胃癌組織及癌旁正常組織中MACC1蛋白的表達，并分析其與臨床病理資料的關系，結果發現MACC1蛋白的異常高表達與分化程度、腹膜轉移、淋巴轉移、臨床分期密切相關，MACC1可以作為預測腹膜轉移、淋巴轉移，評價胃癌進展的有效指標，為胃癌患者的臨床診療提供依據。隨后進一步發現，MACC1是胃癌的癌基因，可影響胃癌的術后復發，促進胃癌細胞的侵襲和遷移，并可能是通過誘導上皮間質轉化（EMT）的途徑而影響胃癌的惡性生物學行為。然而關于MACC1在胃癌生長調控的作用及其機制尚少見報道。本研究運用RNAi沉默MGC-803細胞中MACC1基因表達，通過噻唑藍比色（MTT）實驗、平板克隆形成實驗和流式細胞術檢測細胞周期實驗證實，下調MACC1基因的表達后，MGC-803細胞的體外增殖能力明顯變慢，同時MGC-803細胞中與細胞周期相關因子CDK4、CCND1和c-myc表達量減少，P21的表達量增加，提示沉默MACC1基因的表達能夠明顯抑制胃癌細胞的增殖能力，且對細胞增殖能力的抑制主要是通過其對細胞周期進程的調控而實現的。

綜上所述，MACC1作為一種新發現的癌基因，不僅可影響EMT的發生，增強胃癌細胞的侵襲和遷移能力，而且通過對細胞周期進程的調控，影響細胞的分裂增殖過程，增強胃癌細胞的增殖能力。MACC1可以作為治療胃癌的有效靶點，其具體的機制有待進一步研究。

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（2014-06-18收稿2014-12-04修回）

（本文編輯魏杰）

Effect of MACC1 down-regulation on proliferation of gastric adenocarcinoma cell line

LUO Yi，LIU Lupei，YU Lu
Department of Emergency，Liuzhou People′s Hospital Affiliated to Guangxi University of Technology，Guangxi 545006，China

ObjectiveTo study the effects of MACC1 down-regulation on the growth of gastric adenocarcinoma cells.MethodssiRNA（MACC1-siRNA1 and MACC1-siRNA2）that can transiently silenced MACC1 was designed，syn?thesized and transfected into MGC-803 cells by lipofectamine 2000.Non-specific siRNA was transfected to be used as nega?tive control.The efficiency of MACC1 depletion was determined by Real-time quantitative PCR.MTT，colony formation and flow cytometry assay were performed to examine cell proliferation.The expressions of MACC1，P21，CDK4，CCND1 and cmyc were determined by Western blot.ResultsCompared with cells in negative control group，transiently silencing MACC1 decreased the expression of MACC1 in MGC-803 cells shown by Real-time PCR.MACC1 downregulation drastical?ly changed the proliferation，colony formation and cell cycle of gastric adenocarcinoma cells in vitro（P＜0.05）.The expres?sions of MACC1，CDK4，CCND1 and c-myc proteins in cells of MACC1 silence group were much lower while P21 expres?sion level was much higher than those in negative control.ConclusionDown-regulation of MACC1 result in blocking cell cycle，inhibiting proliferation of MGC-803 cells.So it may serve as a promising target in the treatment of gastric cancer.

stomach neoplasms；adenocarcinoma；cell proliferation；cell cycle；RNA interference；MACC1；MGC-803 cell

R735.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.007

廣西科技大學附屬柳州市人民醫院急癥科（郵編545006）

羅毅（1978），男，副主任醫師，碩士，主要從事胃腸道腫瘤發病機制研究