基于轉錄組分析氯化鈣對青圓椒采后機械損傷品質的影響

周新原，桑兆澤，白春美，鄭鄢燕，賈麗娥，王 清，左進華，牟建樓

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.北京市農林科學院農產品加工與食品營養研究所，農業農村部蔬菜產后處理重點實驗室，果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，北京 100097；3.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013）

青圓椒（Capsicum annuumL.）為茄科、辣椒屬植物，富含胡蘿卜素和VC等營養物質，具有抗氧化、延緩衰老的作用，此外，還具有鎮痛、解熱、預防癌癥、促進消化和加速脂肪代謝的保健作用，因此青圓椒是世界范圍內重要農業經濟作物[1-2]。青圓椒在運輸過程中易發生擠壓、墜落、磕碰等情況，造成不可避免的機械損傷，使得青圓椒果實的組織結構遭到破壞，使其極易受到病菌侵害，加速腐爛變質，促進衰老進程，導致其商品價值和食用價值下降[3]。本實驗不僅探究了氯化鈣對采后青圓椒機械損傷后在貯藏過程中果實品質的影響，并為以后從分子層面探究果蔬貯藏保鮮的研究提供了方向。鈣離子是植物細胞膜和細胞壁的重要組成部分，對于維持細胞膜功能正常和細胞壁結構穩定具有重要作用[4]。氯化鈣無毒、無味、味微苦，是果蔬采后鈣處理常用的鈣鹽[5]。劉瑤等[6]研究了氯化鈣處理對機械損傷番茄果實生理特性的影響，發現氯化鈣處理可以維持機械損傷番茄在貯藏期間的感官品質，降低腐爛率，延長貨架期。王云香等[7]通過1-甲基環丙烯處理受到機械損傷的青圓椒，發現其可以有效延緩采后機械損傷青圓椒的衰老進程，保持果實的貯藏品質，延長青圓椒果實的貨架期。李琪等[8]以琯溪蜜柚為試材，通過對果實進行跌落及劃傷處理，研究不同機械損傷處理對果實的損傷程度差異及其對果實貯藏生理品質的影響，實驗結果表明，劃傷及跌落傷都會對琯溪蜜柚正常生理代謝產生影響，使果實衰老進程加快，嚴重影響正常生命代謝活動，而且同種傷害時，傷害程度越大，果實貯藏品質越低。陳娟娟等[9]探究氯化鈣和水楊酸結合處理對辣椒冷藏過程中貯藏品質的影響，其研究結果表明辣椒采后用質量分數1%的氯化鈣溶液處理會降低質量損失，抑制辣椒中VC含量的下降，提高辣椒的感官評分。目前，對于果蔬貯藏保鮮的研究大多停留在表觀生理生化實驗，而對于其分子層面的研究較少。本研究通過高通量測序技術對青圓椒轉錄組進行測序分析，以青圓椒的質地、色澤、風味香氣、植物激素和轉錄因子作為切入點，篩選關鍵基因，并對其進行分析，旨在為青圓椒采后貯藏及運輸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘京甜三號’青圓椒采收于北京延慶區東小營村。

聚乙烯保鮮袋（40 cm×30 cm，厚度0.03 mm）北京華盾雪花有限公司；氯化鈣 北京化學試劑公司；RN40 RNA提取試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司；RNA Nano 6000試劑盒 美國安捷倫公司；帶有Oligo（dT）的磁珠、Fragmentation Buffer 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設備

CR-300色差計 日本 Konica Minolta公司；XMTD-6000型數顯恒溫水浴鍋 余姚金電儀表有限公司；GY-2型硬度計 浙江托普儀器有限公司；YP20002型電子天平余姚市金諾天平儀器有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 青圓椒處理方法

挑選色澤呈深綠色、大小一致、果實充分膨大、無機械損傷、無病蟲害且達到商業成熟度的青圓椒果實進行實驗。為模擬在運輸中受到機械損傷的青圓椒，采用高處墜落法將篩選后的青圓椒在1 m高處進行自由落體運動，挑選墜落后無開裂的青圓椒分為2 組，對照組50個青圓椒用去離子水浸泡20 min，氯化鈣處理組50個青圓椒用1 mmol/L的氯化鈣溶液浸泡20 min。然后將兩組青圓椒取出晾干，裝入聚乙烯保鮮袋于20 ℃下貯藏，于0、2、4、6、8、10、12 d取樣，留取3個青圓椒果實進行感官評價，剩余樣品立即用液氮冷凍后置于-80 ℃貯藏。

表1 青圓椒感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of green bell peppers

1.3.2 感官評價方法

由經過標準培訓的10 名人員（5 男5 女）組成品評小組，取青圓椒果實根據表1進行評分，感官評分越高，說明該青圓椒的感官品質越好。評分1～3 分為不可接受，4～6 分為品質一般，7～9 分為商品價值較高。

1.3.3 硬度測定

采用GY-2型數顯水果硬度計進行測定，探頭直徑為0.8 cm，每次選取3個果實（不去皮），在青圓椒赤道位置選取3個點，探頭穿透青圓椒測得相應的硬度，取平均值。

1.3.4 色澤測定

采用CR-300色差計測定青圓椒果實色澤，每組選取3個青圓椒果實，在青圓椒果實的赤道位置選取3個點，測定其a*（紅綠度）、b*（黃藍度）和L*值（明亮度）。

1.3.5 轉錄組分析

取對照組貯藏第0、12天樣品（分別記為CK 0和CK 12）、氯化鈣處理組貯藏第12天樣品（記為氯化鈣12）進行轉錄組分析。參照RNA提取試劑盒說明書提取青圓椒RNA。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定RNA濃度和純度。采用RNA Nano 6000分析試劑盒分析RNA完整性。

樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入Fragmentation Buffer將mRNA進行隨機打斷；以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA Polymerase I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇；最后通過聚合酶鏈式反應富集得到cDNA文庫。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應對文庫的有效濃度（＞2 nmol/L）進行定量，以保證文庫質量。采用高通量測序技術進行測序。

差異倍數（fold change，FC）表示兩組樣品間基因相對表達量的比值。以FC≥2且錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.01作為差異基因篩選標準。根據美國國家生物技術信息中心非冗余蛋白質序列（non-residual protein sequence，Nr）、蛋白質家族（Pfam）、同源蛋白質組簇（KOG/COG）、人工注釋和審查的蛋白質序列數據庫Swiss Prot、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本體論（gene ontology，GO）6個數據庫對差異基因功能進行注釋。

1.4 數據處理與分析

實驗設置3個平行，結果以平均值±標準差表示。采用Origin軟件作圖，采用Excell軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 氯化鈣處理對青圓椒感官品質的影響

果蔬的感官品質是影響消費者購買決策的第一指標，新鮮的青圓椒色澤鮮亮瑩綠，質地脆硬，水分充足，整體飽滿。如圖1所示，青圓椒在貯藏期間感官評分總體呈下降趨勢，但氯化鈣處理后的青圓椒感官評分始終高于對照組。由此可知，氯化鈣浸泡處理后可延長機械損傷青圓椒的貯藏期，維持其感官品質。

圖1 氯化鈣處理對青圓椒感官品質的影響Fig. 1 Effect of CaCl2 treatment on the sensory quality of green bell peppers

2.2 氯化鈣處理對青圓椒硬度的影響

硬度是評價青圓椒品質的重要指標之一，質地過軟，則容易腐爛變質，口感較差，影響消費者購買欲望。如圖2所示，青圓椒的硬度隨貯藏時間的延長而逐漸降低，并且在貯藏期間1 mmol/L氯化鈣處理后的青圓椒硬度均高于對照組。在貯藏12 d時對照組的青圓椒硬度相比0 d時下降了28.49%，而氯化鈣處理后的青圓椒硬度僅下降了18.47%。結果表明，1 mmol/L的氯化鈣處理可有效延緩機械損傷青圓椒的硬度降低。

圖2 氯化鈣處理對青圓椒硬度的影響Fig. 2 Effect of CaCl2 treatment on the hardness of green bell peppers

2.3 氯化鈣處理對青圓椒色澤品質的影響

果實的色澤是青圓椒重要外觀指標之一，新鮮的青圓椒顏色翠綠光亮，隨著青圓椒的成熟和衰老，青圓椒的顏色則由翠綠轉為暗綠色或者變為紅色。如圖3A所示，在貯藏期間CK組與氯化鈣處理組的a*值呈上升趨勢，表明青圓椒由翠綠色開始逐漸變化，且氯化鈣處理后的青圓椒a*值均略低于CK組（P＜0.05），說明氯化鈣處理可以較好地維持青圓椒的翠綠色，延緩青圓椒的轉色與衰老。如圖3B所示，兩組青圓椒的b*值在貯藏期內呈逐漸增加的趨勢，即黃色加深，0～6 d兩組青圓椒b*值無明顯差異，貯藏第8天時氯化鈣處理組青圓椒的b*值則低于CK組。如圖3C所示，兩組的青圓椒L*值基本呈波動下降的趨勢，與CK組相比，氯化鈣處理組L*值變化幅度較小。結果表明，青圓椒經氯化鈣處理后受到機械損傷仍可較好地維持其原有色澤。

圖3 氯化鈣處理對青圓椒a*（A）、b*（B）、L*（C）值的影響Fig. 3 Effect of CaCl2 treatment on a* (A), b* (B) and L* (C) values ofgreen bell peppers

2.4 氯化鈣處理的青圓椒差異基因比較分析結果

對照組貯藏12 d前后（CK 0 vs CK 12）的差異基因表征了經機械損傷青圓椒在貯藏過程中一系列基因變化，而貯藏12 d后對照組和氯化鈣處理組（CK 12 vs 氯化鈣12）的差異基因則表征了氯化鈣處理對機械損傷青圓椒果實貯藏后一系列基因表達的影響。CK 12 vs氯化鈣12中共有596個重復基因，其中336個基因相對表達量上調，260個基因相對表達量下調，通過功能鑒定分析這些基因對果實質地變化、色澤積累、風味物質變化、植物激素的產生和轉錄因子的影響。

2.4.1 氯化鈣處理對青圓椒色澤相關基因表達的影響

果實顏色的呈現與類胡蘿卜素的合成代謝有關，共鑒定了14個與色澤相關的差異基因，包括編碼雙功能15-順式八氫番茄紅素合酶（bifunctional 15-cisphytoene synthase，PSY）、辣椒紅色素/辣椒紅色素合酶（capsanthin/capsorubin synthase，CCS）、β-胡蘿卜素羥化酶1（beta-carotene hydroxylase 1，BCH1）、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶4（carotenoid cleavage dioxygenase 4，CCD4）等的基因。如圖4所示，與CK 0相比，CK 12中BCH1、CCS、PSY的相對表達量提高，其中PSY相對表達量提高了7.81 倍，CCS相對表達量提高了205.34 倍，BCH1相對表達量升高至CK 0的23.53 倍，CCD4相對表達量降低至CK 0的4.8%；而用氯化鈣處理的青圓椒果實貯藏12 d后CCD4相對表達量較CK 12提高了18.68 倍，PSY相對表達量為CK 12的7.17%，CCS相對表達量為CK 12的1.25%，BCH1相對表達量為CK 12的5.01%。

圖4 氯化鈣處理對青圓椒色澤相關基因表達差異性分析結果Fig. 4 Differential expression analysis of color-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

2.4.2 氯化鈣處理對青圓椒質地相關基因表達的影響

貯藏期間共鑒定出68個與果實質地相關的差異基因。這些基因編碼包括許多與細胞壁代謝有關的酶，如纖維素合酶A（cellulose synthase A，Ces）、多聚半乳糖醛酸酶2（polygalacturonase 2，PG2）、內切-1,3-β-葡萄糖苷酶4（endo-1,3-β-glucosidase 4，β-Glu）和內切葡聚糖酶25（endoglucanase 25，EG25）等，它們在細胞壁降解中起著重要作用[10-13]。從圖5可以看出，與CK 0相比，CK 12的β-Glu、Ces和EG25相對表達量下調，PG2相對表達量上調；而氯化鈣12的β-Glu、Ces和EG25等基因表達量的下調受到抑制，PG2相對表達量上調也受到抑制，與CK 12相比氯化鈣12的β-Glu相對表達量增加了944.32%、Ces相對表達量增加了135.34%、EG25相對表達量增加了397.67%，PG2相對表達量降至CK12的2.83%。

圖5 氯化鈣處理對青圓椒質地相關基因表達差異性分析結果Fig. 5 Differential expression analysis of texture-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

2.4.3 氯化鈣處理對青圓椒風味與香氣相關基因表達的影響

風味和香氣物質不僅影響果蔬的感官品質和營養品質，而且在一定程度內會影響消費者的選擇[14]。果蔬的香氣和風味主要與糖、酸、氨基酸、脂肪酸和類胡蘿卜素等揮發性物質的合成相關[15]。本研究共鑒定出21個與果實風味和香氣相關的差異表達基因。與CK 12相比，氯化鈣12中有14個基因相對表達量下調，7個基因相對表達量上調。如表2所示，氯化鈣處理有效抑制了貯藏期間亞油酸9S-脂肪氧化酶5、谷胱甘肽S-轉移酶U7（glutathioneS-transferase U7，GSTsU7）和乙醇脫氫酶7（alcohol dehydrogenase 7，ADH7）、奇跡素基因相對表達量下調，抑制貯藏期間2-異丙基蘋果酸合酶A（alanine aminotransferase 2，AlaAT2）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）等基因相對表達量上調。

表2 青圓椒風味與香氣相關基因差異表達分析結果Table 2 Differential expression analysis of flavor and aroma-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

2.4.4 氯化鈣處理對植物激素相關基因表達的影響

乙烯、脫落酸、生長素和赤霉素等植物激素有助于調節果實成熟和衰老過程。本研究共鑒定出29個與植物激素相關的差異表達基因，其中包括參與乙烯生物合成參與植物激素信號傳導途徑的乙烯反應因子113（ethylene reaction factor 113，ERF113）、生長素反應蛋白16（auxin reaction protein 16，IAA16）、脫落酸8’-羥化酶1（abscisic acid 8’-hydroxylase 1，ABAH1）等。與CK 12相比，氯化鈣12的15個差異基因相對表達量下調，14個差異基因相對表達量上調。從圖6可以看出，與CK 0相比，CK 12的ERF113和IAA16相對表達量下調，ABAH1相對表達量上調，經過氯化鈣處理后，與CK 12相比，氯化鈣12的ERF113相對表達量提高了21.67 倍，IAA16相對表達量提高了13.82 倍，ABAH1相對表達量下降了62.42%。

圖6 氯化鈣處理對青圓椒植物激素相關基因表達差異性分析結果Fig. 6 Differential expression analysis of phytohormone-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

2.4.5 氯化鈣處理對青圓椒貯藏保鮮過程中涉及轉錄因子表達的影響

青圓椒在貯藏保鮮過程中主要涉及的轉錄因子有ABC家族、bHLH、ERF、WRKY、NAC、MYB等。R2R3-MYB轉錄因子家族成員直接或間接靶向關鍵酶基因，能影響果實糖、酸、香味、黃酮類、單寧、木質素等物質合成和積累，調節了風味品質以及營養品質組成[16]。本研究共鑒定出53個與轉錄因子相關的差異表達基因。如圖7所示，與CK 0相比，CK 12中bHLH149相對表達量下調，WRKY轉錄因子（WRKY transcription factor 75，WRKY75）、MYB108和含NAC結構域的蛋白質2（NAC domain-containing protein 2，NAC2）等基因相對表達量上調；而氯化鈣處理可以明顯減弱這些變化。經過氯化鈣處理后，與CK 12相比，氯化鈣12的bHLH149相對表達量升高了1.21 倍，WRKY 75相對表達量降低了41.64%，MYB 108相對表達量降低了53.22%，NAC2相對表達量降低了68.08%。

圖7 氯化鈣處理的青圓椒轉錄因子相關基因表達差異性分析結果Fig. 7 Differential expression analysis of transcription factor-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

3 討 論

青圓椒果實的顏色變化主要與類胡蘿卜素和葉綠素的合成代謝相關，類胡蘿卜素及葉綠素對青圓椒果實的顏色起著重要作用，葉綠素的降解，以及辣椒紅素和β-胡蘿卜素的合成，導致青圓椒的外觀顏色從綠色變成紅色[17]。已有研究表明，青圓椒由綠轉紅主要受CCS、PSY和BCH等基因的調控[18-20]。通過沉默CCS、PSY或BCH基因中的任何一種都可以直接或間接影響青圓椒中類胡蘿卜素的積累[21]。在本實驗中，未經氯化鈣處理的青圓椒果實在貯藏過程中，CCS、PSY和BCH1等基因相對表達量大幅度提高，顏色表型也發生變化，而經過氯化鈣處理的青圓椒果實中CCS、PSY和BCH1基因表達受到抑制，氯化鈣處理延緩了青圓椒的轉紅速率，能夠較好地維持青圓椒色澤。

軟化是果實成熟衰老的標志之一，果實軟化主要與細胞壁的降解相關，植物的細胞壁主要由纖維素和果膠組成，當細胞壁降解酶相互協調共同作用導致這兩種物質發生降解時，果實也隨之軟化甚至發生腐爛[22-25]。有研究表明，果實的硬度與β-Gal和PG2活性呈極顯著負相關，β-Gal和PG2活性越高，果實軟化速度越快[26]。本研究貯藏期間，與CK 12相比，氯化鈣12中β-Glu、Ces和EG25相對表達量上調，PG2相對表達量下調，細胞壁合成受到影響，氯化鈣處理后，PG2相對表達量大幅度下降，因而延緩青圓椒的軟化。本研究氯化鈣處理可以通過抑制與細胞壁相關的酶基因的表達來延緩青圓椒果實的細胞壁降解和軟化。

青圓椒的風味物質主要與萜類、甾體、苯丙酸、半胱氨酸等氨基酸和不飽和脂肪酸合成途徑有關，香氣成分主要與醇、醛、酯等揮發性物質的合成代謝相關[27-30]。有研究表明乙醛經乙醇脫氫酶催化生成乙醇，隨后乙醇酯化產生酯類物，該類物質主要表現果香味、甜味，對果實風味形成有一定正向作用[31]。在本研究中，從CK 12與氯化鈣12比較可以看出，氯化鈣處理能夠抑制AlaAT2和PAL等基因相對表達量上調，延緩ADH7、GSTsU7和亞油酸9S-脂肪氧化酶5等基因相對表達量下調。與CK 0相比，CK 12中ADH7相對表達量下調，果實正常香氣風味的合成受到影響，與CK 12相比，氯化鈣12中ADH7相對表達量上調，能夠較長時間維持其正常風味，保持其品質。以上結果表明，氯化鈣處理能夠通過調節果實風味與香氣相關酶基因的表達來影響香氣與風味的變化，進而保持青圓椒原本的風味香氣，減少不良氣味的產生。

乙烯是影響呼吸躍變型果實成熟進程的重要激素物質，在果實采后貯藏過程中參與細胞壁降解導致果實軟化，而青圓椒屬于非呼吸躍變型果實，有研究表明乙烯在非呼吸躍變型果實中同樣參與果實成熟衰老[32]。本研究青圓椒在貯藏期間，與CK 0相比，CK 12乙烯感知下游基因ERF113下調。而與CK 12相比，氯化鈣12中的ERF113基因上調，ERF113可能與乙烯合成呈拮抗關系，表明氯化鈣處理對青圓椒中乙烯合成相關酶進行調控，減少了乙烯的合成，從而延緩青圓椒的衰老和質地的軟化。此外，有研究表明，乙烯、脫落酸能夠促使貯藏期間薄皮甜瓜果實中PG、PME、β-Gal活性升高，以調節果實細胞壁多糖、果膠物質的變化，促進果實軟化[33]。與CK 0相比，CK 12的ABAH1和PG2相對表達量上調，而與CK 12相比，氯化鈣12中的ABAH1和PG2相對表達量下調，質地變軟緩慢。Aux/IAAs和ARFs是生長素信號通路中的兩個主要轉錄調節因子，生長素能夠拮抗乙烯或脫落酸的影響來抑制果實成熟[34-37]。本研究中機械損傷青圓椒中的IAA16等相對表達量在氯化鈣處理后有所提高，ABAH1相對表達量下調，與對照組相比，氯化鈣處理組的青圓椒比對照組的青圓椒衰老較慢。由此可知，氯化鈣能夠對青圓椒果實中植物激素進行調控，并通過植物激素間的相互促進、拮抗作用，延緩青圓椒果實機械損傷帶來的危害。

4 結 論

氯化鈣處理不僅能夠延緩水果品質的劣變、營養的流失還能延長其貯藏期，而且對于有機械損傷的水果，仍能起到很好的保鮮效果[38]。本研究使用氯化鈣對受到機械損傷的青圓椒進行處理，分析其生理特性、營養品質及基因在貯藏期間的變化，發現氯化鈣能夠延長機械損傷青圓椒的貯藏時間，保持青圓椒的品質，有效維持青圓椒的硬度，降低其轉紅速率，對青圓椒的腐爛有抑制作用。此外，氯化鈣可能通過抑制CCS和PSY等基因的上調來抑制類胡蘿卜素的合成，通過抑制β-Glu、Ces和EG25等基因的下調來緩解其軟化，并通過影響青圓椒中某些轉錄因子、植物激素和香氣風味相關基因的表達，進而影改善有機械損傷的青圓椒果實的表觀品質。