凍結及凍藏溫度對小龍蝦凍藏過程中脂質氧化的影響

楊海琦，陳季旺，徐 言，田宏偉，廖 鄂,3,4，王海濱,3,4

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.湖北周黑鴨食品工業園有限公司，湖北 武漢 430000；3.湖北省農產品加工與轉化重點實驗室，湖北 武漢 430023；4.國家小龍蝦加工技術研發分中心（潛江），湖北 潛江 433100）

小龍蝦養殖具有季節性和地域性，這嚴重影響了其加工生產和銷售，因此，小龍蝦需要更長的貯藏期（3個月以上）以延長加工和銷售周期。凍藏能夠最大程度地延緩水產品的品質變化，抑制微生物和酶的活性，延長水產品的貯藏期[1-3]。雖然小龍蝦中的脂質含量較低，但是不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFAs）含量高，在長期的凍藏過程中，這些脂質易發生氧化。脂質氧化不僅改變了小龍蝦的風味，還會導致小龍蝦色澤和質地的劣變[4-6]。

國內外有關凍藏水產品脂質氧化的報道較多，水產品中UFAs在較低的溫度下能保持液體狀態，受到冰晶擠壓后更容易被轉移到外界，與氧接觸而發生氧化[7-9]。此外，冰晶可以在凍藏過程中擠壓甚至破壞肌肉細胞，使其釋放誘導脂質氧化的促氧化劑（游離鐵等），加快脂質氧化[10-11]。傅寶尚等[12]研究凍藏條件（預熟制和直接凍藏）對鮑魚腹足脂質變化的影響，通過水蒸氣蒸餾法和氣相色譜質譜聯用儀測定硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric reactive substances，TBARS）值和游離脂肪酸（free fatty acids，FFAs）含量。結果顯示，鮑魚中的脂質氧化主要發生在凍藏時期，預熟制工藝較好地延緩了凍藏過程中脂質的氧化。徐坤華等[13]研究了藍鰭金槍魚的脂質和肌紅蛋白在-18、-30、-40、-50 ℃凍藏溫度下的氧化動力學，結果顯示，隨著凍藏溫度的升高，TBARS值和高鐵肌紅蛋白的含量增加，且變化規律符合Arrhenius化學反應動力學方程。

目前，工業化生產中常采用液氮凍結或者鼓風凍結小龍蝦原料及其制品。然而，凍結和凍藏溫度的選擇通常依靠經驗判斷，造成了不同批次產品風味、質構、色澤等品質的不穩定。本課題組前期研究發現，凍結及凍藏溫度顯著影響了小龍蝦凍藏過程中的品質和蛋白質的理化性質，但有關凍結溫度、凍藏溫度如何影響凍藏小龍蝦脂質氧化的研究目前鮮見報道。因此，本研究測定經不同溫度凍結和凍藏小龍蝦肉的脂肪、FFAs含量、脂肪酸組成以及過氧化值（peroxide value，POV）和TBARS值，分析小龍蝦凍藏過程中的脂質氧化規律，探討凍結及凍藏溫度對小龍蝦脂質氧化的影響，以期為小龍蝦加工原料的周年供應提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活小龍蝦 湖北周黑鴨食品工業園有限公司提供。

石油醚、三氯乙酸、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、甲苯、吡啶乙酸銅、正丁醇、甲醇（均為分析純）和正己烷（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；0.01 mol/L硫代硫酸鈉、三氟化硼-甲醇溶液 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DW-60W388超低溫冰柜 青島海爾生物醫療有限公司；S2F-06C脂肪測定儀 浙江托普儀器有限公司；XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技有限公司；7200型可見光分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；7890B氣相色譜-質譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 凍藏小龍蝦的制備

將大小均一（約10～15 g）的鮮活小龍蝦用自來水沖洗，超聲波清洗（水的添加量以覆蓋蝦體為準）20 min，然后放入沸水中熱燙1 min，裝盒（每盒1 kg小龍蝦），盒中灌入清水（水的添加量以覆蓋蝦體為準）后抽成真空。盒裝小龍蝦分別置于-20、-40、-55 ℃冰柜中凍結至中心溫度為-15 ℃。將凍好的蝦隨機分為兩組，分別置于-20 ℃和-40 ℃冰柜中凍藏，凍藏周期為24 周，每6 周取樣用于檢測。每次隨機取約1 kg小龍蝦，使用流動水解凍。取蝦肉時去除頭、殼和腸線，蝦肉置于-55 ℃冷柜中放置3 h，使水分凍結成冰后放入真空冷凍干燥機中，-55 ℃、30 kPa冷凍干燥后粉碎，置于真空袋中，抽真空封口備用。

1.3.2 脂肪質量分數的測定

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[14]的索氏抽提法測定脂肪質量分數。取3 g凍干蝦肉粉移入濾紙筒中，濾紙筒兩端塞入脫脂棉，并用脫脂棉線將濾紙筒固定。將濾紙筒置于索氏抽提器內的抽提筒中，然后將抽提筒放進接收瓶（已烘干至恒質量）內。接收瓶內加入瓶容積2/3左右的石油醚，水浴加熱（60 ℃），使石油醚不斷回流并抽提脂肪，抽提時間3.5 h。提取結束時，用磨砂玻璃棒蘸取一滴提取液，若無油斑則表明提取完畢。取下接收瓶，等瓶內溶劑蒸發至剩余1～2 mL后，于60 ℃水浴加熱0.5 h，蒸發接收瓶內多余的石油醚。蒸發完全后置于105 ℃烘箱中干燥1 h，干燥器內冷卻至室溫（25 ℃）后稱量。脂肪質量分數按公式（1）計算。

式中：ω為蝦肉中的脂肪質量分數/%；m1為恒質量的接收瓶和脂肪質量/g；m0為接收瓶的質量/g；m2為蝦肉粉的質量/g。

1.3.3 總脂質的提取

采用Folch法提取總脂質[15]。將20 g蝦肉粉用200 mL三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）溶解，勻漿至分散后，室溫（25 ℃）下用磁力攪拌器將整個混合物攪拌20 min。過濾勻漿物，收集過濾液。在過濾液中加入一定量的去離子水（每20 mL過濾液加4 mL水），渦旋10 s，離心（5 000 r/min）混合物至分離成兩相。用甲醇-水（1∶1，V/V）溶液沖洗兩液交界面2 次，注意不要沖洗到下層液相。將混合液移入分液漏斗中，靜置分層3 h，取下層液相，在旋轉蒸發器中蒸發含有脂質的下層氯仿相，即得到脂質。

1.3.4 FFAs含量的測定

參照Lowry等[16]的方法測定FFAs含量。稱取0.1 g脂質，溶于5 mL甲苯中，然后加入1 mL吡啶乙酸銅溶液（質量分數5%，pH 6.0），振蕩2 min。混合液于室溫（25 ℃）下3 000 r/min離心5 min，測定上清液在715 nm波長處的吸光度。FFAs含量用每100 g脂質中FFAs的質量表示。

1.3.5 脂肪酸組成的測定

脂肪酸組成的測定參考文獻[17]的方法。

樣品甲酯化：稱取30 mg脂質，氮氣吹掃，加入1 mL 2 mol/L NaOH-甲醇溶液，混合均勻后于60 ℃水浴保溫2 min，再加入1 mL 2 mol/L三氟化硼-甲醇溶液，混勻后于水浴中繼續放置5 min，取出，于室溫（25 ℃）下加入2 mL正己烷，振蕩搖勻后靜置。待分層后取含脂肪酸甲酯的上層正己烷，加入一定量無水硫酸鈉脫除水分，使用0.22 μm孔徑的有機相濾膜過濾后進行氣相色譜-質譜分析，進樣量1 μL。

色譜條件：分析柱為HP-5MS（30 cm×0.25 mm，0.25 μm），高純氦氣為載氣，采用恒壓模式，壓力為16 psi。進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為150 ℃，柱溫以2 ℃/min由150 ℃上升到210 ℃，并且于210 ℃下保持15 min，整個分析過程為45 min。

質譜條件：接口溫度280 ℃，電子電離離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描周期2.84 次/s，質量掃描范圍m/z50～500。

1.3.6 POV的測定

參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》[18]中的滴定法測定POV。稱取3 g脂質，置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，輕輕振搖使脂質完全溶解。準確加入1 mL飽和碘化鉀溶液，塞緊瓶蓋，并輕輕振搖0.5 min，在暗處放置3 min。取出加100 mL水，搖勻后立即用0.01 mol/L硫代硫酸鈉標準液滴定析出的碘，滴定至淡黃色時，加1 mL淀粉指示劑，繼續滴定并強烈振搖至溶液藍色消失為終點。同時進行空白實驗，空白實驗所消耗0.01 mo1/L硫代硫酸鈉溶液體積不得超過0.1 mL。POV按公式（2）計算。

式中：V為脂質消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積/mL；V0為空白消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積/mL；c為硫代硫酸鈉標準溶液濃度/（mol/L）；m為脂質質量/g。

1.3.7 TBARS值的測定

參照李學英等[19]的方法。取3 g攪碎的蝦肉，加入15 mL質量分數為7.5%的三氯乙酸溶液（含0.1%乙二胺四乙酸），均質1 min后過濾。取5 mL過濾液加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，沸水浴加熱20 min，混合物冷卻至室溫（25 ℃）后離心，得到上清液。上清液中加入5 mL質量分數為7.5%的三氯甲烷溶液渦旋混勻，靜置分層，取上清液。用分光光度計分別測定532 nm和600 nm波長處的吸光度。TBARS值按公式（3）計算。

式中：A532nm為在532 nm波長處測得的吸光度；A600nm為在600 nm波長處測得的吸光度。

1.4 數據處理與分析

每組數據重復測定3 次，結果用平均值±標準差表示。應用SPSS軟件對數據進行統計分析，采用方差分析、Duncan多重極差檢驗比較平均值的差異顯著性，P＜0.05判定為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小龍蝦凍藏過程中脂肪含量的變化

水產品凍藏過程中脂肪含量的變化受自身氧化或被酶水解的影響，金屬催化劑和其他促氧化因子都可以加快氧化過程[20]。由表1可以看出，6 組小龍蝦肉的脂肪含量隨著凍藏時間的延長均呈先下降然后趨于穩定的趨勢，且第24周較第12周脂肪含量顯著下降。這是因為凍藏過程中冰晶體積增大，破壞了細胞膜結構，使得膜上的非血紅素鐵被釋放、氧自由基轉化成羥自由基，加快了脂質氧化的發生[21]。

表1 小龍蝦凍藏過程中脂肪質量分數的變化Table 1 Changes in fat content of red swamp crayfish during frozen storage %

凍藏溫度相同時，凍結溫度對小龍蝦肉中脂肪質量分數的影響不顯著（P＞0.05）；凍結溫度相同時，在第18～24周，-40 ℃凍藏小龍蝦肉中的脂肪質量分數顯著高于-20 ℃組（P＜0.05）。這是因為小龍蝦在-20 ℃凍藏過程中更容易發生重結晶，更嚴重地破壞了肌肉細胞膜，釋放出更多的非血紅素鐵，促進脂肪氧化。同時，由于包裝盒內的真空度較低，小龍蝦肉與空氣接觸可能發生自動氧化，-20 ℃凍藏溫度較高，自動氧化速度較快，導致脂肪含量較低[4-5]。此外，-40 ℃凍藏溫度可能更好地抑制了蝦肉中脂肪酶的作用，降低了脂肪被水解的程度[22]。

2.2 小龍蝦凍藏過程中FFAs含量的變化

脂質的水解程度是評價小龍蝦品質劣變程度的常用指標，FFAs是脂質被酯酶水解或者化學水解的產物，通過測定FFAs含量可以反映脂質的水解程度[23]。由圖1可以看出，6 組小龍蝦肉的FFAs含量隨凍藏時間的延長逐漸增加（P＜0.05），可能是隨著冰晶體積的增大，破壞了肌肉細胞，釋放的脂質被酯酶水解，導致FFAs含量增加[24]。同時，在第12～24周FFAs含量較高（P＜0.05），導致脂質更快的氧化酸敗。這與脂肪含量在第12～24周顯著減少相印證（P＜0.05）。

圖1 小龍蝦凍藏過程中FFAs含量的變化Fig. 1 Changes in FFAs contents of red swamp crayfish during frozen storage

凍藏溫度相同時，凍結溫度對FFAs含量的影響不顯著（P＞0.05）；凍結溫度相同時，-40 ℃的凍藏溫度相較-20 ℃明顯降低了FFAs含量。這與武華等[25]的研究結果類似，-40 ℃凍藏更好地抑制了小龍蝦中酯酶的活性，降低了脂質被酶水解的程度。

2.3 小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化

小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化見表2～4。小龍蝦肉中被檢測出的脂肪酸合計13種，可分為飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）和UFAs兩類，其中UFAs又可以分為單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）。小龍蝦肉中，UFAs含量較多，SFAs含量較少，且PUFAs含量高于MUFAs含量。脂質的氧化速率與組成脂質的脂肪酸不飽和度、雙鍵位置和構型有關，共軛雙鍵數目越多，氧化速度越快[26]。UFAs含量較高，脂質氧化速度加快，這也是小龍蝦肉脂肪含量在凍藏期間顯著下降的原因之一。

隨凍藏時間的延長，6 組小龍蝦肉中的SFAs相對含量顯著上升（P＜0.05），UFAs和PUFAs相對含量顯著下降（P＜0.05），同時MUFAs相對含量變化不顯著（P＞0.05），說明在整個凍藏周期里，主要發生氧化的是PUFAs。

在所有的脂肪酸中，油酸（C18:1n9）、二十碳五稀酸（C20:5n3）和棕櫚酸（C16:0）相對含量較高。油酸（C18:1n9）是MUFA的一種，在整個凍藏周期內，油酸相對含量變化不顯著（P＞0.05）。MUFAs不含共軛雙鍵，被氧化需要接觸更多氧，而小龍蝦經過液封并抽真空處理，凍藏過程中可接觸的氧較少，所以MUFAs相對含量總體無顯著變化（P＞0.05）；二十碳五稀酸（C20:5n3）是PUFAs的一種，隨著凍藏時間的延長其相對含量顯著下降（P＜0.05）。這可能是PUFAs所含共軛雙鍵較多，在凍藏過程中易被氧化。Oh[27]和Sover[28]等均報道凍藏過程中的蛋白質變性會導致一部分非血紅素鐵被釋放出來，可能促進脂肪酸氧化。因此，蛋白質變性可能也是PUFAs不斷被氧化而減少的原因；棕櫚酸（C16:0）是一種SFA，隨著凍藏時間的延長其相對含量逐漸增加。脂質在酯酶的作用下水解產生SFAs，SFAs較穩定[24]，因此在小龍蝦肉中的相對含量逐漸增加。

表2 －20 ℃凍結的小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化Table 2 Changes in fatty acid composition of red swamp crayfish frozen at -20 ℃ during frozen storage %

表3 －40 ℃凍結的小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化Table 3 Changes in fatty acid composition of red swamp crayfish frozen at –40 ℃ during frozen storage %

表4 －55 ℃凍結的小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化Table 4 Changes in fatty acid composition of red swamp crayfish frozen at –55 ℃ during frozen storage %

凍藏溫度相同時，凍結溫度對小龍蝦肉的脂肪酸組成有輕微影響；凍結溫度相同時，凍藏溫度對脂肪酸組成有明顯影響。顯微結構觀察發現，-20 ℃凍藏的小龍蝦中形成的冰晶較大（圖未顯示），對肌原纖維蛋白的破壞程度較高，釋放出的非血紅素鐵促進了游離脂肪酸的氧化。同時，-20 ℃凍藏提高了脂質的自動氧化速度，加重了脂質的氧化程度[4-5]，導致-20 ℃凍藏小龍蝦的PUFAs含量低于-40 ℃凍藏。

2.4 小龍蝦凍藏過程中POV的變化

POV代表脂質初級氧化產物的含量。由圖2可以看出，6 組小龍蝦肉POV隨凍藏時間的延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。這是因為小龍蝦肉中UFAs含量較高，共軛雙鍵數目較多，氧化速度較快[29]。

凍藏溫度相同時，-20 ℃凍結的小龍蝦肉POV總體高于-40 ℃和-55 ℃。這是因為較高的凍結溫度會形成更大的冰晶，這些冰晶擠壓蝦肉細胞，使其形變甚至破裂，造成促氧化劑和脂質等流出，加快了脂質氧化的速度，導致POV更高[29]；凍結溫度相同時，-40 ℃凍藏的小龍蝦肉的POV明顯低于-20 ℃組。這可能由兩種原因造成：一是-40 ℃凍藏小龍蝦的冰晶增大速度較慢，使得冰晶在整個凍藏周期內均小于-20 ℃凍藏組，冰晶越小，破壞的蝦肉細胞越少，減少了促氧化劑和脂質等的流出；二是-40 ℃凍藏降低了脂質自動氧化的速度，減輕了脂質被氧化的程度。

圖2 小龍蝦凍藏過程中POV的變化Fig. 2 Changes in POV of red swamp crawfish during frozen storage

2.5 小龍蝦凍藏過程中TBARS值的變化

TBARS值代表小龍蝦脂質氧化次級產物的含量。由圖3可以看出，小龍蝦肉的TBARS值隨凍藏時間的延長總體呈顯著上升的趨勢（P＜0.05）。這與林二妹[30]報道的結果類似，可能是小龍蝦肉脂質氧化的初級產物不斷降解生成丙二醛所致。

凍藏溫度相同時，凍結溫度對TBARS值的影響總體不顯著（P＞0.05）；凍結溫度相同時，在凍藏前期，-20 ℃凍藏小龍蝦肉的TBARS值略高于-40 ℃凍藏組；凍藏至第24周時，-20 ℃凍藏小龍蝦肉的TBARS值略高于-40 ℃凍藏組，可能是凍藏溫度-40 ℃較-20 ℃更好地抑制了脂質的自動氧化[31-32]。這個結果與脂肪和FFAs含量、脂肪酸組成及POV的變化趨勢類似，進一步說明了較低的凍結及凍藏溫度抑制了脂質的水解，減輕了凍藏過程中脂質的氧化。

圖3 小龍蝦凍藏過程中TBARS值的變化Fig. 3 Changes in TBARS values of red swamp crayfish during frozen storage

3 結 論

-40 ℃和-55 ℃凍結的小龍蝦肉中形成的冰晶較小，對肌肉細胞的破壞程度較輕，減少了促氧化劑和脂質等的釋放，抑制了脂質的水解和氧化；-40 ℃凍藏更好地抑制了重結晶及蝦肉中酯酶的活性，減輕了對小龍蝦肌肉細胞的損傷，減緩了脂質的水解速率。同時，-40 ℃凍藏減緩了脂質自動氧化的速率。因此，較低的凍結及凍藏溫度減輕了凍藏過程小龍蝦肉中脂質的氧化程度。在-20～-55 ℃區間，低溫加快了凍結速率，但并非選擇更低的凍結溫度能使小龍蝦達到更佳的貯藏效果，而較低的凍藏溫度（-40 ℃）更好地抑制了小龍蝦凍藏過程中的脂質氧化。該研究結果可為小龍蝦加工原料的周年供應提供科學指導。