羊棲菜多酚通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB/絲裂原活化蛋白激酶通路緩解脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)

黃 平，洪靜霞，米 杰，張攀學(xué)，李 超，楊文鴿

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

炎癥是宿主應(yīng)對(duì)感染、細(xì)胞應(yīng)激或組織損傷的一種防御適應(yīng)性反應(yīng)，受多種信號(hào)通路調(diào)控，以保證炎癥過程的啟動(dòng)、維持和消退[1-2]。當(dāng)機(jī)體免疫反應(yīng)異常活躍，可引起過度炎癥，導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷[3]。巨噬細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過執(zhí)行多種功能（吞噬、產(chǎn)生和分泌多種細(xì)胞因子和生長因子）參與免疫調(diào)節(jié)[4]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），又稱內(nèi)毒素，為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，可作用于膜受體激活多種細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子和其他炎性介質(zhì)的合成及釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)[5]。LPS激活巨噬細(xì)胞的過程主要包括：巨噬細(xì)胞膜上Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）識(shí)別LPS，使TLR4胞內(nèi)的基團(tuán)構(gòu)象發(fā)生變化，將信號(hào)傳入胞內(nèi)，激活細(xì)胞中多種蛋白質(zhì)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)鏈，最終激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）和核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor，NF）-κB信號(hào)通路，促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，如一氧化氮（NO）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及其上游炎癥酶誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6等[6-7]。

羊棲菜（Hizikia fusiformis）作為一種可食性褐藻，廣泛分布于我國浙江沿海一帶，富含多種活性物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值高[8]。羊棲菜多酚（Hizikia fusiformispolyphenols，HFPs）是羊棲菜中重要活性物質(zhì)之一，約占藻體干質(zhì)量的2%，HFPs主要為間苯三酚衍生物及連苯三酚衍生物，具有抗氧化[9]、抗菌[10]、抗炎[11]及抑制代謝酶[12]等作用。倪立穎等[11]采用LPS刺激胚胎期斑馬魚建立體內(nèi)炎癥模型，評(píng)估HFPs提取物的抗炎活性，結(jié)果表明HFPs提取物顯著降低胚胎斑馬魚體內(nèi)NO水平、細(xì)胞死亡率和活性氧生成率。Yang等[13]在研究HFPs體外抗炎功效時(shí)發(fā)現(xiàn)，其減少了巨噬細(xì)胞促炎因子（NO、IL-6和TNF-α）的分泌。目前，有關(guān)HFPs抗炎作用的報(bào)道主要集中于其對(duì)部分炎性介質(zhì)的影響，而缺乏系統(tǒng)而深入的機(jī)制研究。本研究采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立體外炎癥模型，基于MAPKs和NF-κB信號(hào)通路，從基因、蛋白相對(duì)表達(dá)水平和細(xì)胞吞噬功能等方面評(píng)估HFPs的抗炎活性，為其在新型抑炎制劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜干制品（產(chǎn)自浙江洞頭海域） 溫州星貝海藻食品有限公司。

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

達(dá)爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、DMEM/F12無酚紅培養(yǎng)基、胎牛血清 美國HyClone公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、LPS、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、高效RIPA細(xì)胞快速裂解液 北京索萊寶科技有限公司；N-(1-萘基)乙二胺鹽酸鹽、對(duì)氨基苯磺酰胺 上海源葉生物科技有限公司；TRIzol試劑 美國Omega公司；綠色熒光微球 北京百靈威科技有限公司；Taq-based聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 日本ToYoBo公司；FastStart Essential DNA Green Master 美國Roche公司；c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）兔單克隆抗體、p-JNK兔單克隆抗體、p38 MAPK兔多克隆抗體、p-p38 MAPK兔多克隆抗體、NF-κB p65兔單克隆抗體、p-NF-κB p65兔單克隆抗體、iNOS兔多克隆抗體 武漢愛博泰克生物科技公司；Tris緩沖鹽溶液+吐溫（Tris buffered saline+tween，TBST）洗膜液 山東思科捷生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）免疫印跡檢測(cè)試劑 江蘇新賽美生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1300系列A2型生物安全柜、梯度PCR儀、恒溫恒濕培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher Scientific公司；SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；CFX 96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Gallios流式細(xì)胞儀 美國Beckman公司；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D轉(zhuǎn)印槽 北京六一儀器廠；ChemiScope 4300 pro化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊棲菜多酚的制備

參照Wang Chen[14]、李亞嫻[15]等的方法并略作修改。取干燥羊棲菜粉末，加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液超聲輔助浸提（料液比1∶20（m/V）、50 ℃、60 min），抽濾后真空減壓蒸餾去除乙醇，獲羊棲菜粗多酚溶液，依次采用等體積石油醚、乙酸乙酯分級(jí)萃取，真空減壓蒸餾后凍干，獲得HFPs粉末。測(cè)得HFPs粉末總酚含量為（23.67±0.24）mg/g。利用無菌水配制成多酚母液，再以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至不同濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

完全培養(yǎng)基（含10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基）培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，細(xì)胞融合度約80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3.3 RAW264.7細(xì)胞活力測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以3×105個(gè)/mL接種于96 孔板，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后，更換為含不同質(zhì)量濃度（0（即對(duì)照組）、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL）HFPs的新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。棄去上清液，加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的DMEM/F12無酚紅培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育4 h。再次棄去上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜，37 ℃振蕩30 min，測(cè)定540 nm處OD540nm值。按公式（1）計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.4 RAW264.7細(xì)胞NO相對(duì)含量測(cè)定

參照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行細(xì)胞接種，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為3 組：陰性對(duì)照組、LPS陽性對(duì)照組、HFPs+LPS組。陰性對(duì)照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；LPS陽性對(duì)照組加入含LPS（1 μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h；HFPs+LPS組經(jīng)含不同質(zhì)量濃度（10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL）HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h。采用Griess法測(cè)定各組在540 nm處OD540nm值，按公式（2）計(jì)算NO相對(duì)含量。

1.3.5 RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以4×105個(gè)/mL接種于6 孔板，每孔2.5 mL。細(xì)胞分為3 組：陰性對(duì)照組，LPS陽性對(duì)照組、HFPs+LPS組。LPS陽性對(duì)照組在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激3、6、12、24 h；HFPs+LPS組經(jīng)含不同質(zhì)量濃度（30、60、90、120 μg/mL）HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激3、6、12、24 h；陰性對(duì)照組用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后吸棄培養(yǎng)液，用含不同質(zhì)量濃度（0、30、60、90、120 μg/mL）HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L、pH 7.2（后同）的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞2 次，每孔加入500 μL TRIzol試劑提取總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Green嵌合熒光法與引物（表1）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。測(cè)定目的基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）和內(nèi)參基因次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1）Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.6 RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定

參照李煜等[16]的方法并略作修改。按照1.3.5節(jié)方法分組進(jìn)行藥物處理，陰性對(duì)照組為無LPS和HFPs處理，LPS組和HFPs+LPS組LPS刺激3 h后，去除培養(yǎng)基，加入1 mL熒光微球工作液（1×107個(gè)/mL）避光孵育2 h。收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2 次，加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，經(jīng)75 μm尼龍膜過濾后立即采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞熒光強(qiáng)度。以實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組熒光強(qiáng)度的比值百分?jǐn)?shù)表征細(xì)胞吞噬能力。

1.3.7 MAPKs、NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

按照1.3.5節(jié)方法進(jìn)行分組和處理，陰性對(duì)照組為無LPS和HFPs處理，LPS組和HFPs+LPS組LPS刺激誘導(dǎo)24 h后，收集細(xì)胞。加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，離心（12 000 r/min、4 ℃）10 min取上清液。采用BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，用蛋白上樣緩沖液調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，95 ℃加熱10 min使蛋白變性然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜；5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）脫脂奶粉（TBST溶液配制）封閉1 h；一抗4 ℃孵育12 h；二抗室溫孵育2 h；加入ECL試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定蛋白條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK，分別以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相應(yīng)蛋白磷酸化水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Prism 8.3軟件進(jìn)行單因素方差分析。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，當(dāng)HFPs質(zhì)量濃度不高于160 μg/mL時(shí)，其對(duì)細(xì)胞活力無明顯作用；進(jìn)一步提高多酚質(zhì)量濃度后，HFPs顯著抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05），并呈劑量依賴性，當(dāng)HFPs質(zhì)量濃度達(dá)到350 μg/mL，細(xì)胞活力顯著降為對(duì)照組的50%（P＜0.05）。

圖1 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 1 Effects of HFPs on the viability of RAW264.7 cells

2.2 HFPs對(duì)RAWA264.7細(xì)胞NO相對(duì)含量的影響

巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，可產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)包括促炎細(xì)胞因子、前列腺素和NO等。如圖2所示，與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞經(jīng)LPS刺激24 h后，其NO相對(duì)含量顯著升高（P＜0.05）。與陽性對(duì)照相比，采用HFPs預(yù)處理可劑量依賴性緩解LPS刺激導(dǎo)致的NO產(chǎn)生，且當(dāng)HFPs質(zhì)量濃度為100 μg/mL以上時(shí)，抑制效果顯著（P＜0.05）。

圖2 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO生成量的影響Fig. 2 Effect of HFPs on NO production in RAW264.7 cells

2.3 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白表達(dá)的影響

如圖3A所示，LPS顯著刺激細(xì)胞iNOS基因轉(zhuǎn)錄（P＜0.05），且iNOSmRNA表達(dá)水平隨LPS誘導(dǎo)時(shí)間延長而增加。HFPs預(yù)處理24 h后再經(jīng)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞，HFPs對(duì)iNOSmRNA表達(dá)水平的影響與LPS刺激時(shí)間有關(guān)，短期LPS刺激（0～12 h）后HFPs對(duì)iNOSmRNA表達(dá)水平無明顯作用，而當(dāng)LPS誘導(dǎo)時(shí)間延長至24 h時(shí)，HFPs（60～120 μg/mL）處理顯著降低了iNOSmRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步印證了該結(jié)果，60～120 μg/mL HFPs預(yù)處理顯著降低了LPS誘導(dǎo)24 h巨噬細(xì)胞iNOS蛋白水平（P＜0.05）（圖3B、C）。

圖3 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of HFPs on the expression of iNOS mRNA and protein in RAW264.7 cells

2.4 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥基因相對(duì)表達(dá)量的影響

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定HFPs對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中重要促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量，以及炎癥相關(guān)酶COX-2基因相對(duì)表達(dá)量的影響。如圖4所示，LPS刺激不同時(shí)間后，所有炎癥介質(zhì)的mRNA表達(dá)水平均顯著提高（P＜0.05）。HFPs對(duì)促炎細(xì)胞因子的抑制作用與其劑量、LPS誘導(dǎo)時(shí)間及細(xì)胞因子種類相關(guān)。與LPS組相比，靜息狀態(tài)細(xì)胞經(jīng)HFPs處理再經(jīng)LPS誘導(dǎo)12、24 h后，IL-1β和IL-6的基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降；HFPs顯著抑制LPS誘導(dǎo)3 h后TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)，而在LPS誘導(dǎo)6～24 h的抑制作用總體不明顯。在LPS誘導(dǎo)24 h，較低劑量HFPs（30、60 μg/mL）預(yù)處理對(duì)COX-2基因表達(dá)具有顯著抑制作用，但提高劑量后該抑制效果消失，甚至出現(xiàn)反向促進(jìn)作用，120 μg/mL HFPs預(yù)處理促使COX-2相對(duì)表達(dá)量較LPS組顯著上升（P＜0.05）。

圖4 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥介質(zhì)基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of HFPs on gene expression of inflammatory mediators in RAW264.7 cells

2.5 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響

如圖5所示，與陰性對(duì)照組相比，LPS刺激3 h顯著促進(jìn)了細(xì)胞吞噬熒光微球的能力（P＜0.05）。經(jīng)60、90、120 μg/mL HFPs預(yù)處理后，LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力受到顯著抑制（P＜0.05）。

圖5 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響Fig. 5 Effect of HFPs on phagocytic capacity of RAW264.7 cells

2.6 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞MAPKs、NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的影響

采用蛋白免疫印跡法測(cè)定巨噬細(xì)胞中MAPKs和NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。如圖6所示，與陰性對(duì)照組相比，LPS刺激3 h后細(xì)胞中p38、JNK和p65蛋白的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）。90、120 μg/mL HFPs預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中p38和p65的磷酸化產(chǎn)生顯著抑制作用（P＜0.05），且呈一定的劑量依賴性，但對(duì)JNK的磷酸化沒有顯著影響，表明HFPs的抗炎作用可能與其靶向作用于p38 MAPK和NF-κB p65有關(guān)。

圖6 HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞MAPKs和NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的影響Fig. 6 Effect of HFPs on the expression of key proteins involved in MAPKs and NF-κB signaling pathways in RAW264.7 cells

3 討 論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的第一道防線，具有識(shí)別、吞噬、清除細(xì)菌及外來異物等功能[17]。然而，當(dāng)巨噬細(xì)胞被異常激活，可分泌大量促炎細(xì)胞因子進(jìn)而引發(fā)炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致機(jī)體組織損傷，故其靜息-激活的動(dòng)態(tài)平衡在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中起重要作用[18]。針對(duì)過度免疫反應(yīng)，一般可通過阻斷或抑制炎癥相關(guān)因子的表達(dá)達(dá)到緩解炎癥及其引起的機(jī)體損傷。

細(xì)胞增殖能力是機(jī)體的重要生命特征和體現(xiàn)細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。MTT法是一種簡單、快捷、無放射性污染測(cè)定細(xì)胞活力的方法[19]，在本研究中用于評(píng)估HFPs對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的潛在細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，HFPs的最大安全質(zhì)量濃度為160 μg/mL，即不高于該劑量時(shí)HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力無影響。

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，又名內(nèi)毒素，是引起機(jī)體炎癥損傷的重要誘因，可激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、iNOS、COX-2等多種炎癥介質(zhì)和IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子[20-22]。IL-1β大量產(chǎn)生于炎癥初期，其局部激活是介導(dǎo)促炎反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，可導(dǎo)致繼發(fā)性炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[20]；TNF-α具有多效性，能增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其他細(xì)胞因子的合成和釋放[23]；IL-6作為重要促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)T細(xì)胞活化、增殖及分化，參與機(jī)體免疫應(yīng)答[24]。研究表明，這些細(xì)胞因子及其他炎性介質(zhì)的大量釋放，與炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[25-26]。本研究結(jié)果表明，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，其炎癥介質(zhì)基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）表達(dá)顯著增加，而這一現(xiàn)象在HFPs預(yù)處理后得到緩解，并呈劑量和時(shí)間依賴性。Kim等發(fā)現(xiàn)間苯三酚可降低LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達(dá)水平，抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[27]。Kang等則研究發(fā)現(xiàn)褐藻Eisenia bicyclis提取物抑制LPS激活的HepG2細(xì)胞中iNOS和COX-2的表達(dá)[28]。結(jié)合本研究結(jié)果，表明HFPs及其他褐藻多酚可通過調(diào)節(jié)多種炎性介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄水平來抑制炎癥的發(fā)生。

巨噬細(xì)胞的吞噬功能在機(jī)體防御病原體感染中發(fā)揮重要作用。需要注意的是，過多的免疫細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞）被激活，將增加炎癥風(fēng)暴風(fēng)險(xiǎn)[18]。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記廣泛應(yīng)用于巨噬細(xì)胞吞噬功能評(píng)估[16]。本研究利用該技術(shù)檢測(cè)了HFPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬功能的影響。結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，其吞噬熒光微球的能力顯著提升，這與Wen Li等[29]的發(fā)現(xiàn)一致。采用HFPs預(yù)處理后，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞吞噬能力受到抑制，表明HFPs通過調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬功能緩解了炎癥反應(yīng)。

NF-κB是具有多種生物活性的核轉(zhuǎn)錄因子，能通過快速調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、突變和炎癥反應(yīng)等生理病理過程[30]。細(xì)胞經(jīng)內(nèi)毒素刺激可誘發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活NF-κB并核轉(zhuǎn)位，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白的表達(dá)，促進(jìn)炎癥相關(guān)因子的合成與分泌[18]。Yoon等發(fā)現(xiàn)馬尾藻（Sargassum micracanthum）提取物通過NF-κB信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6等mRNA水平的上調(diào)[31]。Yayeh等研究表明，在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中，褐藻Eisenia bicyclis多酚提取物通過抑制NF-κB p65及其上游激酶的磷酸化降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[32]。除NF-κB外，MAPK也是巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要因子，其磷酸化可進(jìn)一步導(dǎo)致NF-κB的激活[33]。Jung等[34-35]研究發(fā)現(xiàn)，苷苔（Ecklonia cava）提取物能夠降低LPS誘導(dǎo)的小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位及其DNA結(jié)合能力，而這一現(xiàn)象與抑制MAPKs的激活有關(guān)。目前，NF-κB/MAPKs信號(hào)通路的激活水平，即相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，被廣泛應(yīng)用于評(píng)估和篩選抗炎活性物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可顯著促進(jìn)關(guān)鍵蛋白的磷酸化（p-p65、p-p38、p-JNK），而HFPs預(yù)處理可劑量依賴性抑制p-p65和p-p38的表達(dá)，表明HFPs的抗炎活性與調(diào)控p38 MAPK和NF-κB p65信號(hào)通路有關(guān)。不同抗炎藥物的抗炎機(jī)制不同，但主要通過阻斷或遏制炎癥相關(guān)通路，或直接中和機(jī)體中促炎介質(zhì)以達(dá)到抗炎效果[36]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HFPs可選擇性抑制LPS激活的p38/NF-κB信號(hào)通路，減少了IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和COX-2等的表達(dá)，從而緩解炎癥。

綜上所述，HFPs可通過抑制NF-κB/MAPKs信號(hào)通路蛋白p65和p38的磷酸化水平，減少促炎細(xì)胞因子和其他炎性介質(zhì)的合成與分泌，降低巨噬細(xì)胞吞噬作用，從而發(fā)揮抗炎活性。值得注意的是，許多報(bào)道證實(shí)了體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果具有良好的相關(guān)性[37]，但生物體內(nèi)情況復(fù)雜，化合物在體內(nèi)外的作用效果可能出現(xiàn)差異，如多酚進(jìn)入體內(nèi)后可能會(huì)被胃液分解成小分子酚類物質(zhì)，導(dǎo)致效果減弱[38]。因此，在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上還需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以確定HFPs在完整生物體中產(chǎn)生的抗炎作用，為其開發(fā)新的抗炎藥物提供重要依據(jù)。