加工方式對魚餅小清蛋白免疫原性和致敏性的影響

周林杰，陸佳達，施文正，盧 瑛,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306）

食物過敏是指過敏人群對食物過敏原的異常免疫反應，嚴重的食物過敏可能導致過敏性休克，危及生命[1]，是當前世界上影響過敏人群健康的重要公共衛生問題。相關調查顯示，世界上食物過敏人群數量逐年增長，約有8%的兒童和3%的成年人有不同程度的食物過敏癥狀[2]。根據聯合國糧食及農業組織調查[3]顯示，魚類及其制品是過敏食物中的一大類，目前只能通過避免食用過敏食品或緩解過敏癥狀來控制。

魚類的主要過敏原是小清蛋白（parvalbumin，PV），其分子質量為10～12 kDa，主要存在于魚肌肉的肌漿蛋白中，大部分對魚類及其制品的過敏反應是由PV引起的[4]。目前，消減PV的加工方法有多種，如通過美拉德反應對PV賴氨酸殘基進行糖基化修飾，修飾后PV免疫原性下降[5]。高卿等[6]研究木糖葡萄球菌發酵對鱸魚PV免疫原性的影響發現，發酵60 h后PV的免疫原性顯著降低。此外，不同加工技術的組合可以更有效地降低水產品過敏原的致敏性，王麗娟等[7]發現經高壓結合酶法處理的蝦肉，其主要過敏原原肌球蛋白的免疫原性消減率達到97%。實驗室前期研究發現高溫高壓技術可以顯著降低蝦類過敏原的致敏性，因此高溫高壓技術與乳酸菌發酵相結合可能會提供一種降低食物致敏性的新途徑。

本研究分別采用加熱、高溫高壓、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）發酵和發酵-高溫高壓聯合處理（簡稱F-HP）制備魚餅，通過酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和傅里葉變換紅外光譜分析不同處理組魚餅中主要過敏原PV的免疫原性和二級結構的變化，通過BALB/c小鼠過敏模型評價不同加工處理對PV致敏性的影響，以期為食物過敏原的控制與消減以及低致敏性魚制品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、動物、材料與試劑

副干酪乳桿菌為本課題組前期從奶豆腐中分離純化。

BALB/c小鼠購自上海捷思捷實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK（滬）2018-0004，本研究動物實驗方法均經上海海洋大學動物保護評審委員會批準，批準編號：SHOU-DW-2021-003。

白鰱魚 上海臨港蘆潮港水產市場；MRS（de Man-Rogosa-Sharpe ）培養基 青島海博生物技術有限公司；預染色和未染色的蛋白質標記物，3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液 上海碧云天生物技術有限公司；鼠抗PV單克隆抗體 無錫迪騰敏生物科技有限公司；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色液 美國Sigma公司；羊抗鼠辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G上海威奧生物科技有限公司；羊抗鼠HRP-IgE抗體美國arigo公司；小鼠血清組胺、細胞因子（白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13）檢測試劑盒上海酶免生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Mini protean 4蛋白質電泳儀 美國Bio-Rad公司；AE-8135半干式轉膜儀 日本ATTO公司；Powerlook 2100XL-MSB凝膠掃描儀 美國MMAX公司；Synergy2多功能酶標儀 美國BioTek公司；Z36HK高速冷凍離心機德國Hermle公司；TS-8脫色搖床 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；MLS-3750高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵菌種的培養

將副干酪乳桿菌接種在MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養至穩定期，調整活菌數1×108CFU/mL以上，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，收集沉淀，將菌體重懸于5 mL生理鹽水中，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 不同加工方式制備魚餅

新鮮白鰱魚除去魚鱗、魚鰓和內臟，清洗后采肉切塊（3 cm×3 cm×2 cm）。將魚肉粉碎并添加魚肉質量分數3%的氯化鈉和5%的葡萄糖，混勻后平鋪在魚餅模具中，然后采用不同加工方式制備魚餅。加熱組：100 ℃沸水蒸制15 min；高溫高壓處理組：置于高壓滅菌鍋，121 ℃分別處理10、20、30、40、50 min；發酵處理組：在魚餅中接種1×108CFU/g副干酪乳桿菌，密封后置于30 ℃恒溫培養箱中發酵12、24、36、48 h；F-HP處理組：將發酵12、24、36、48 h的魚餅于高壓滅菌鍋中121 ℃處理20 min；上述魚餅均保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.3.3 魚餅中小清蛋白的制備

參考文獻[8]的方法，將分別取5 g不同處理組魚餅，加入30 mL、4 ℃ Tris緩沖液（pH 7.4、0.1 mol/L，含0.5 mmol/L甘氨酸和0.1 mmol/L二硫蘇糖醇，后同），均質處理1 min后得到蛋白粗提液。將粗提液于4 ℃冰箱放置12 h后10 000 r/min離心30 min，收集上清液。然后用Tris緩沖液溶解沉淀物，浸提5 h，4 000 r/min離心30 min，收集合并兩次上清液得到魚餅PV粗提液。用0.1 mol/L、pH 7.4（后同）磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）透析24 h得到魚餅PV富集液，冷凍干燥后得到不同處理組PV，于-20 ℃冰箱保存備用。取魚肉粉碎后按照相同操作制備天然PV。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡分析

參考文獻[9]的方法。分離膠質量分數12%，濃縮膠質量分數5%，標準蛋白上樣量為8 μL，樣品蛋白（加熱組魚餅的PV粗提液和富集液）上樣量為10 μL。樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離后，用半干式轉膜儀，200 mA反應20 min將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上。加入5 g/100 mL脫脂奶粉在37 ℃反應1 h，用含吐溫-20的PBS（phosphate buffered salinetween，PBST）洗滌3 次。以PV的特異性單克隆抗體（1∶10 000）為一抗，孵育1 h。洗滌后以羊抗鼠HRP-IgG（1∶2 500）為二抗，孵育1 h。洗滌后加入DAB顯色液顯色，用去離子水洗去多余的顯色液后拍照觀察。

1.3.5 間接酶聯免疫吸附試驗測定PV的免疫原性

參考文獻[10]的方法略作修改。取不同處理組PV和天然PV用50 mmol/L碳酸鹽緩沖溶液（pH 9.6）配制質量濃度20 μg/mL溶液，以100 μL/孔加入酶標板中，4 ℃反應12 h。PBST洗滌3 次后加入5 g/100 mL脫脂奶粉（200 μL/孔），37 ℃孵育2 h。洗滌后以鼠抗PV單克隆抗體（1∶10 000）為一抗（100 μL/孔），37 ℃孵育1 h；洗滌后以羊抗鼠HRP-IgG（1∶5 000）為二抗（100 μL/孔），37 ℃孵育1 h，洗滌后加入TMB顯色液（100 μL/孔）顯色10 min后，加入2 mol/L的硫酸溶液（50 μL/孔）終止顯色，用酶標儀測定450 nm波長處光密度（OD450nm）。以不含樣品的50 mmol/L碳酸鹽緩沖溶液作為陰性對照。按下式計算IgG結合能力消減率，以表征PV的免疫原性。

式中：ΔOD0為天然PV與陰性對照組OD450nm的差值；ΔOD1為其他處理組與陰性對照組OD450nm的差值。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

參考文獻[11]的方法，加熱組、高溫高壓組（121 ℃處理20 min）、發酵組（發酵48 h）和F-HP組（發酵48 h后121 ℃處理20 min）和天然PV冷凍干燥樣品中加入KBr晶體（質量比1∶100）混合壓成薄片，以空氣為背景，在4 000～400 cm-1范圍內采集光譜，每個樣品重復掃描3 次。利用Peakfit軟件對PV樣品的紅外光譜原始圖進行基線校準、二階導數處理，根據吸收峰的積分面積計算各二級結構相對含量。

1.3.7 BALB/c小鼠過敏模型的建立

參考文獻[12]的方法略作修改，將30 只BALB/c雌性小鼠適應性喂養1 周后隨機分為5 組（n＝6），以PBS溶液為抗原設為陰性對照組，即PBS組；以不同處理組PV凍干粉末為抗原設為實驗組。

1.3.7.1 致敏小鼠血清特異性IgE抗體水平的測定

第1、21、28天不同處理組小鼠分別腹腔注射100 μg相應處理組PV（用PBS配制2 mg/mL PV溶液，然后加入等體積弗氏完全佐劑振蕩乳化），PBS組腹腔注射等體積PBS乳液。腹腔注射24 h后對各組小鼠進行尾尖采血，離心（4 000 r/min、20 min）收集血清。按照1.3.5節方法，以實驗室前期提取純化的鰱魚PV為樣品，采用間接ELISA法分析小鼠血清中IgE抗體水平的變化情況。將PV用50 mmol/L碳酸鹽緩沖溶液（pH 9.6）稀釋至5 μg/mL，一抗采用小鼠血清（1∶1 000），二抗采用羊抗鼠HRPIgE抗體（1∶2 500），測定OD450nm以表征IgE抗體水平。

1.3.7.2 灌胃激發后小鼠過敏表現評分及血清中組胺和Th2型細胞因子質量濃度的測定

參考文獻[13]的方法并略作修改，第35天各組小鼠均灌胃0.5 mg加熱組（100 ℃沸水蒸制15 min）、高溫高壓組（處理20 min）、發酵組（發酵48 h）和F-HP組（發酵48 h后高溫高壓處理20 min）PV（用PBS配制2 mg/mL PV溶液進行灌胃）激發小鼠。激發后1 h內觀察小鼠過敏表現并評分，具體評分標準見表1。

表1 小鼠過敏表現評分標準[13]Table 1 Criteria for evaluation of allergic symptoms in in mice[13]

激發24 h后采用放血法處死小鼠，取小鼠心臟部位血液，離心（4 000 r/min、20 min）收集血清，按照1.3.5節方法小鼠血清中IgE抗體水平（OD450nm），并分別參照相應ELISA試劑盒說明書測定致敏小鼠血清中的組胺和輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2）型細胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）的質量濃度。

1.4 數據處理與分析

結果均以平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan多重比較進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 加工方式對魚餅免疫原性的影響

2.1.1 魚餅粗提液和富集液PV的鑒定

加熱組魚餅PV粗提液和富集液的SDS-PAGE圖譜如圖1A所示，Jiang Xingyi等[14]研究報道PV分子質量為10～12 kDa，本研究魚餅PV的主要條帶在10 kDa處附近。免疫印跡結果如圖1B所示，10 kDa處附近條帶與PV的特異性單克隆抗體有反應，故該條帶被鑒定為白鰱魚的PV。

圖1 魚餅中PV粗提液和富集液的SDS-PAGE（A）和免疫印跡結果（B）Fig. 1 SDS-PAGE pattern (A) and Western blot pattern (B) of PV from fish cakes

2.1.2 加工方式對魚餅中主要過敏原PV免疫原性和二級結構的影響

如圖2所示，高溫高壓和發酵處理均可以降低魚餅PV的免疫原性，其中高溫高壓處理時間20 min，副干酪乳桿菌發酵48 h和F-HP組發酵48 h后高溫高壓處理20 min的魚餅中PV的IgG結合能力消減率最高，分別為50.6%、34.7%和68.5%，加熱組消減率僅10.4%。研究發現，高溫高壓處理主要通過影響蛋白質分子的非共價相互作用如氫鍵和離子鍵等，間接或直接影響過敏蛋白質的結構[15]。由圖2A可知，高溫高壓處理不同時間制備的魚餅中PV的IgG結合能力消減率均高于30%，作用效果顯著，其中處理20 min時魚餅中PV的IgG結合能力消減率達到最大（50.6%）。如圖2B所示，隨發酵時間的延長，魚餅中PV的IgG結合能力消減率逐漸增加，發酵48 h時達到34.7%。F-HP組制備的魚餅中PV的IgG結合能力變化趨勢與發酵組類似，發酵48 h時為68.5%（圖2C）。Zhu Yidan等[16]采用植物乳桿菌發酵魚肉，與發酵0 h相比，發酵48 h后魚肉中PV的免疫原性降低了39.7%，本研究采用副干酪乳桿菌發酵魚肉，隨著發酵時間的延長，PV免疫原性逐漸降低（圖2B、C）。不同處理組魚餅中，發酵48 h F-HP組魚餅中PV的免疫原性降低最大。

蛋白質紅外光譜酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）的特征振動頻率主要取決于其氨基酸殘基的C＝O和N—H之間的氫鍵性質，可用于反映蛋白質二級結構中α-螺旋（1 650～1 658 cm-1）、β-折疊（1 610～1 640 cm-1）、β-轉角（1 660～1 700 cm-1）及無規卷曲（1 640～1 650 cm-1）等結構相對含量[17]。由圖2D可知，過敏原天然PV的二級結構中α-螺旋相對含量最高，β-折疊相對含量最少，分別為43.9%、9.0%。楊汝晴等[18]研究磷酸化對鰱魚PV免疫原性的影響也發現，天然狀態下PV的α-螺旋相對含量最高，β-折疊相對含量最少。加熱組魚肉PV二級結構中α-螺旋和β-折疊相對含量與天然PV相比沒有明顯變化，這可能是加熱處理對魚肉PV免疫原性影響很小的原因[18]。與天然PV相比，高溫高壓處理后魚肉PV的α-螺旋相對含量降低了10.7%，而β-折疊相對含量增加了7.8%，β-轉角和無規卷曲相對含量均有增加。有研究表明高溫高壓會導致PV的二級結構發生不可逆的變化從而掩蓋其抗原表位[20]。如圖2D所示，發酵處理后，發酵組PV的α-螺旋相對含量較天然PV降低了13.3%，而β-折疊、β-轉角和無規卷曲相對含量均有增加，其中β-折疊相對含量增加了5.1%。肖葉等[21]利用植物乳桿菌及其不同成分提取物處理蝦類原肌球蛋白，發現原肌球蛋白的α-螺旋相對含量明顯減少，β-折疊相對含量顯著增加，原肌球蛋白二級結構的變化影響了其免疫原性。因此推測副干酪乳桿菌發酵過程中的發酵產物對PV的表位有掩蓋作用[22]，從而降低了魚餅中PV的免疫原性。與加熱組相比，其他加工方式中F-HP處理后PV二級結構變化最大。與天然PV相比，F-HP處理后α-螺旋相對含量降低了17.3%，β-折疊相對含量增加了14.8%。

綜上可知，加熱、高溫高壓、發酵和F-HP處理對PV二級結構影響主要為α-螺旋解旋轉變為β-折疊，PV結構的折疊化導致暴露的抗原表位被掩蓋，影響了PV與抗體結合的能力，從而降低了PV蛋白的免疫原性。而單一的加熱、高溫高壓和發酵處理對α-螺旋相對含量降低效果不如F-HP處理，PV的折疊化程度較低，因而相較于發酵48 h F-HP處理，高溫高壓和僅進行發酵處理PV的免疫原性消減率較低。

圖2 加工方式對魚餅中PV免疫原性和二級結構的影響Fig. 2 Effects of processing methods on the immunogenicity and secondary structure of PV from fish cakes

2.2 加工方式對魚餅中主要過敏原PV致敏性的影響

采用BALB/c小鼠構建過敏動物模型，是評價過敏蛋白致敏性最直接的方法之一[23]。因此，本研究以PBS抗原作為陰性對照，各加工處理組魚餅中PV凍干樣品抗原作為實驗組，構建BALB/c小鼠過敏模型，灌胃激發小鼠后1 h內觀察小鼠過敏癥狀，發現過敏原刺激后小鼠出現抽搐、活動減弱等一系列癥狀[24]。各組小鼠的過敏反應評分結果如圖3所示，加熱組蛋白免疫的小鼠表現出不同程度的過敏癥狀，50%的小鼠出現了刺激后無活動的癥狀，1/3的小鼠出現呼吸困難或抽搐等癥狀。PBS組2/3的小鼠無過敏癥狀。高溫高壓組小鼠2/3出現腹瀉或活動減少的癥狀，50%的發酵組小鼠也出現類似現象，而F-HP組2/3的小鼠過敏癥狀整體表現出輕微的癥狀。從過敏癥狀評分結果來看，不同加工處理后魚餅PV導致的小鼠過敏癥狀都有不同程度降低，其中F-HP組小鼠整體過敏癥狀最輕。

圖3 小鼠模型的過敏表現評分（n＝6）Fig. 3 Symptom scores of allergen-induced anaphylactic reactions in mouse model (n = 6)

血清中IgE抗體水平是評價過敏原致敏性的重要指標[25]。本研究測定了小鼠過敏模型構建過程小鼠血清中IgE水平，由圖4A可見，PBS組免疫小鼠血清IgE抗體水平無明顯變化，而加熱組IgE抗體水平隨免疫時間延長逐漸增加。結合上述加熱組過敏癥狀評分結果可知，BALB/c小鼠過敏模型構建成功。如圖4B所示，第35天灌胃不同處理組PV激發后，加熱組小鼠血清中IgE抗體水平（0.766）最高；而高溫高壓組、發酵組和F-HP組的IgE抗體水平均顯著高于PBS對照組，但顯著低于加熱組（P＜0.05）；其中F-HP組IgE抗體水平（0.349）最低，比加熱組降低了54.4%。由此可知，相比于單一加工處理，F-HP組魚餅中PV致敏性降低最為顯著（P＜0.05）。

圖4 BLAB/c小鼠血清中IgE抗體水平Fig. 4 Serum IgE antibody levels in BALB/c mice

組胺是引起全身過敏癥狀的主要物質，小鼠血清中組胺質量濃度可以反映BALB/c小鼠過敏反應的嚴重程度[26]。如圖5所示，高溫高壓組、發酵組和F-HP組小鼠血清組胺質量濃度顯著低于加熱組（P＜0.05），均較加熱組降低了40%以上，其中F-HP組降低了63.6%，略高于PBS組。上述結果表明，加熱處理后魚肉PV的致敏性強烈，高溫高壓、發酵和F-HP處理都可以顯著降低魚餅中PV的致敏性，且F-HP處理對PV致敏性影響最大，降低效果最佳。以上結果與小鼠血清IgE抗體水平相互印證。

圖5 BLAB/c小鼠血清中組胺質量濃度Fig. 5 Histamine levels in serum of BLAB/c mice

為進一步探究不同加工處理消減PV致敏性的機制，本研究分析了不同處理組PV激發致敏后小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13質量濃度。如圖6所示，加熱組IL-4、IL-5和IL-13質量濃度均最高，而高溫高壓組、發酵組和F-HP組均出現了不同程度降低，其中小鼠血清中IL-5質量濃度下降最為顯著，分別較加熱組降低了51.6%、48.6%、47.7%（圖6B）；與加熱組相比，F-HP組IL-13質量濃度下降了34.8%（圖6C）。Th2型細胞產生的細胞因子IL-4、IL-5和IL-13都是促過敏細胞因子，能夠增強機體致敏反應[27]。Luo Chen等[28]報道小鼠經魚類PV的脂肪乳化消化產物免疫后，血清中細胞因子IL-4和IL-13的釋放量顯著增加。本研究結果顯示，與加熱組相比，其他加工處理組魚餅中PV免疫的小鼠血清中的促過敏細胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）的分泌量均降低，其中F-HP組小鼠的細胞因子質量濃度降低效果最好。

圖6 BALB/c小鼠血清中細胞因子質量濃度Fig. 6 Serum cytokine levels in BALB/c mice

BALB/c小鼠過敏模型是評價食物潛在致敏性最直接的方法之一。通過BALB/c小鼠過敏模型，研究發現，與加熱組相比，其他加工處理組PV激發致敏后小鼠的過敏癥狀明顯減弱（圖3），小鼠血清中組胺質量濃度和Th2型細胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）的質量濃度（圖5、6）顯著降低（P＜0.05），小鼠血清中IgE抗體水平均顯著降低（圖4）（P＜0.05），其中F-HP組的小鼠的過敏反應減輕最顯著（P＜0.05）。van der Ventel等[29]將鯉魚PV腹腔注射BALB/c小鼠進行致敏實驗，發現小鼠血清中特異性抗體IgE水平和Th2型細胞因子（IL-4和IL-5）質量濃度顯著升高。根據相關研究[30]可知，當過敏原刺激機體后，Th2細胞被抗原激活后，釋放IL-4、IL-5和IL-13等淋巴因子，進而促進IgE產生。而IgE-抗原復合物與肥大細胞表面受體結合后被激活，然后發生脫顆粒現象，釋放多種炎癥介質如組胺，激活后的肥大細胞還會合成和釋放細胞因子如IL-13，這些因子會進一步增強Th2型過敏反應。因此推測可能是不同加工方式破壞了魚餅中PV的二級結構，掩蓋其抗原表位，導致加工處理組小鼠的Th2型細胞免疫應答效果減輕，進而抑制了其過敏反應，其中聯合加工處理組的降低效果最佳。本研究結果顯示，與加熱組相比，其他加工方式制備的魚餅中的PV致敏性均顯著降低，其中F-HP處理對魚類主要過敏原PV的致敏性影響最為顯著。

3 結 論

本研究通過體外免疫學和紅外分析結合致敏動物模型兩種方法，研究了4種加工處理方式對魚餅主要過敏原PV的免疫原性、二級結構和致敏性的影響作用，發現與加熱組相比，其他處理組中F-HP處理對過敏原PV的二級結構、免疫原性和致敏性影響最為顯著。此外發現加工處理可能會破壞PV的二級結構，致其α-螺旋解旋為β-折疊，PV結構的折疊化導致暴露的抗原表位被掩蓋，減輕Th2型細胞的免疫應答，從而降低過敏反應。本研究為今后開發低致敏性水產制品和過敏原的消減控制技術提供了科學依據。