超聲波處理對糯米全粉凝膠特性的影響及其機制

楊秋曄，劉亞偉，劉 潔

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

糯米是經糯稻去殼加工而成的米，呈不透明或者半透明的白色。糯米中主要含支鏈淀粉（占總淀粉質量的98%）[1]和少量直鏈淀粉（占總淀粉質量1.0%～2.3%）[2]。糯米粉加水調成團經蒸煮糊化冷卻后可形成凝膠，糯米粉凝膠具有黏度大、不易回生且透明度較高等特點[3]，因此常被亞洲人用于制作湯圓、粽子、年糕、糍粑等傳統食品。糯米粉凝膠具有良好的凍融穩定性[4]，有利于冷凍食品在凍融循環過程中保持水分，相較于其他稻米粉，更適宜冷凍食品的制作。目前許多糯米粉凝膠制品例如湯圓，在冷凍處理以及保藏過程中會出現不同程度的脫粉、開裂、塌陷以及煮制后黏牙等現象，嚴重影響了湯圓的品質。這是因為糯米粉團缺乏延展性且本身持水性較差，使得粉團內部水分分布不均勻，在冷凍過程中由于熱量交換，糯米粉團內的水分迅速冷凍產生冰晶使得湯圓皮發生脫水收縮；同時，餡料內的水分結冰膨脹形成內壓從而引起湯圓皮開裂和脫粉[5]。目前工業上改善糯米凝膠的方法主要為使用添加劑，如添加乳化劑、增稠劑和復配食用膠[6]。糯米全粉中淀粉質量分數達80%以上[7]，蛋白質質量分數為6%～8%[8]，因此糯米全粉凝膠的性質主要由淀粉主導，但越來越多的研究表明糯米全粉中蛋白質的組成及含量對糯米全粉凝膠的流變學和質構特性有顯著影響[9]，蛋白質對凝膠的影響主要是由于蛋白質會嵌入在淀粉顆粒內部或以網絡形式黏附在淀粉顆粒表面，造成空間位阻增大，使淀粉不易糊化，抑制凝膠的形成[10]。

超聲波是一種頻率高于人類聽覺閾值（＞16 kHz）的聲波[11]，其頻率范圍為2×104～2×109Hz[12]。高功率（＞5 W/cm2）超聲波已在食品工業中廣泛使用。超聲波輔助提取淀粉時，能夠破壞蛋白質與淀粉之間的聯結促進蛋白質與淀粉分離。近年來，關于超聲波處理淀粉、蛋白質的研究已有很多。然而，關于超聲波處理淀粉與蛋白質共存的全粉的研究鮮有報道。本實驗以糯米全粉為原料，以反映糯米全粉凝膠黏彈性的損耗角正切值（tanδ）為指標進行正交優化試驗，考察糯米全粉凝膠的制備條件，研究超聲波處理對糯米全粉凝膠特性及其對糯米全粉中的主要組分淀粉和蛋白質的影響，進一步探討超聲波處理對糯米全粉的作用機制，為超聲波綠色加工技術在糯米全粉的生產和加工中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米全粉（淀粉質量分數84.34%、蛋白質質量分數6.95%、灰分質量分數0.17%、脂肪質量分數0.82%、水分質量分數7.67%，由實驗室測定） 河南黃國糧業股份有限公司。

三氯乙酸 天津天力化學試劑有限公司；β-巰基乙醇天津大茂化學試劑有限公司；5,5’-二硫基-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 儀器與設備

非接觸式超聲波破碎儀 比利時Diagenode公司；DHR-1流變儀、TA Q20差示掃描量熱儀 美國TA公司；Quanta250掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；Nicolet 傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司；快速黏度分析儀 瑞典Perten公司；TA-XT Plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波處理糯米全粉

1.3.1.1 超聲波處理糯米全粉的制備

稱取一定量糯米全粉配制成不同質量濃度的糯米全粉乳液于50 mL離心管中，漩渦振蕩均勻，置于恒定頻率20 kHz的超聲波破碎儀中（工作30 s停止30 s），在一定的超聲波功率下處理不同時間。在超聲波處理過程中，通過向水槽中加入碎冰使溫度保持在0～9 ℃。將超聲波處理后的糯米全粉乳液抽濾，于45 ℃烘箱中干燥12 h后過80 目篩，制備成超聲波處理糯米全粉（ultrasound treated waxy rice flour，UT-WRF）。

1.3.1.2 凝膠損耗角正切值測定

稱取一定量糯米全粉樣品制備水分質量為52%的粉團，然后用保鮮膜包裹，以免在制作過程中發生干裂。稱取5 g粉團揉搓至圓形，用保鮮膜包裹，放置5 min，將粉團放入蒸鍋中蒸制15 min，冷卻至室溫，制備凝膠。將制備好的凝膠切成厚度約為1 cm片狀，置于流變儀載物臺上，選用直徑為40 mm的平行板夾具，在動態頻率掃描、溫度25 ℃、應變1%（在線性黏彈區范圍內）、頻率掃描范圍0.1～10 Hz條件下，測定凝膠儲能模量（G’）、損耗模量（G’’）以及tanδ（G’’/G’）隨頻率變化的規律[13]。

1.3.1.3 超聲波處理糯米全粉的單因素試驗

以糯米全粉凝膠在頻率10 Hz下的tanδ為指標，研究超聲波功率（130、160、200 W）、超聲時間（5、10、20、30、40 min）、料液比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，m/V）對糯米全粉凝膠tanδ的影響。

1.3.1.4 超聲波處理糯米全粉的正交試驗

在單因素試驗基礎上進行L9(34)正交試驗，研究超聲波功率、超聲波時間和料液比3個因素對凝膠tanδ的影響，確定超聲波處理最佳工藝參數。正交試驗因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Codes and levels of independent variables used for orthogonal array design

1.3.2 糯米淀粉的制備

參考周顯青等[14]的方法并作修改，將糯米全粉加入0.34 g/100 mL NaOH溶液中反應4 h，然后3 000 r/min離心15 min；用1.0 mol/L HCl溶液中和至中性，以3 000 r/min離心15 min，去上清液，重復水洗3 次，將淀粉沉淀在45 ℃烘箱中干燥12 h后過80 目篩，得到糯米淀粉。

1.3.3 糊化特性分析

稱取樣品與蒸餾水混合制備成質量分數10%的乳液。采用快速黏度分析儀，參照GB/T 24852—2010《大米及米粉糊化特性測定 快速粘度儀法》對樣品糊化特性進行測定。設定程序如下：在50 ℃保持1 min，在4 min內勻速升溫至95 ℃，保持3 min，然后在4 min內勻速降溫至50 ℃，保持1 min。

1.3.4 凝膠特性分析

1.3.4.1 凍融穩定性

將樣品與蒸餾水混合制備成質量分數6%的乳液于沸水浴中加熱15 min，同時不停攪拌，完全糊化后，稱取樣品糊與離心管（50 mL）總質量，然后將離心管置于-18 ℃冰箱中冷凍24 h后，30 ℃水浴中解凍4 h，3 000 r/min離心30 min。若有水析出，將水倒去，稱總質量，然后放入冰箱中再次冷凍。如此反復冷凍、解凍循環5 次。析水率按式（1）計算。

式中：m1表示離心管質量/g；m2表示離心管和糊的質量/g；m3表示解凍去水后離心管和糊的質量/g。

1.3.4.2 質構特性

采用P/25探頭測定凝膠的質構特性。測前速率2 mm/s，測中與測后速率均為1 mm/s，壓縮比50%，觸發力5 g。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察樣品形貌

在真空條件下對樣品噴金處理，在加速電壓15 kV條件下進行掃描，觀察不同放大倍數下樣品的形貌。

1.3.6 糯米蛋白質的制備

根據代鈺等[15]的方法有所改進，將20 g糯米粉加入500 mL 0.05 mol/L NaOH溶液中并在磁力攪拌器下攪拌反應90 min，以3 000 r/min離心15 min，將上清液用1.0 mol/L HCl溶液調節pH值為4.6～4.8，再次3 000 r/min離心15 min，沉淀真空冷凍干燥12 h，研磨過80 目篩，得到糯米蛋白質。

1.3.7 糯米蛋白特性分析

1.3.7.1 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Chen Xiangyan等[16]的方法并作修改，將樣品與溴化鉀（質量比1∶100）在瑪瑙研缽中研磨，壓片后進行傅里葉變換紅外光譜掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1。分析酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）的峰[17]。各子峰與二級結構對應關系為：1 610～1 640 cm-1為β-折疊；1 640～1 650 cm-1為無規卷曲；1 650～1 660 cm-1為α-螺旋；1 660～1 700 cm-1為β-轉角。

1.3.7.2 游離巰基和二硫鍵含量測定

游離巰基含量測定：參考Pan Mengmeng等[18]的方法并作修改。稱取100 mg樣品，溶解于10 mL標準緩沖溶液（8 mol/L脲、86 mmol/L Tris、90 mmol/L甘氨酸，pH 8.0）中，3 000 r/min離心15min，得到上清液，用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白質量濃度。向比色管中加入1 mL上清液、4 mL標準緩沖液，再加入0.04 mL DTNB，混合均勻后放入25 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，在412 nm波長處測定溶液吸光度。游離巰基含量按式（2）計算。

式中：73.53為摩爾消光系數/（L/（mol·cm））；A412nm為吸光度；n為稀釋倍數；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）。

總巰基含量：取1 mL蛋白質上清液加入0.1 mLβ-巰基乙醇和4 mL標準緩沖溶液，在30 ℃水浴中反應1 h，然后加入10 mL 12%三氯乙酸溶液混合均勻后4 000 r/min離心15 min，倒掉上清液，向沉淀中再加入5 mL 12%三氯乙酸溶液二次復溶，離心。將沉淀物溶于標準緩沖溶液，加入0.04 mL DTNB顯色，于412 nm波長處測定吸光度。二硫鍵含量按式（3）計算。

1.3.7.3 熱特性分析

用差示掃描量熱儀測定糯米蛋白熱特性。稱取2.5 mg（干基）樣品密封于鋁盤中，測試條件：升溫速率10 ℃/min，溫度范圍為30～200 ℃。

1.4 數據處理與分析

采用Origin 8.5軟件作圖，利用SPSS Statistics 25軟件進行方差分析，結果由平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著。所有實驗均重復3 次。

2 結果與分析

2.1 超聲波處理糯米全粉的最佳工藝參數

2.1.1 單因素試驗結果

料液比1∶2、超聲時間10 min固定不變，超聲波功率對糯米全粉凝膠tanδ的影響如圖1A所示，糯米全粉凝膠的tanδ隨超聲波功率的增大而減小，在130 W時tanδ最大為0.80，tanδ下降即G’’與G’的比值下降，可能是超聲波產生的空化作用削弱了淀粉顆粒與蛋白質之間的聯結，使得蛋白質與淀粉之間形成的三維網絡結構強度減弱[19]。隨著超聲波功率的增大，空化作用加強，凝膠體系的黏彈性下降，故選擇超聲波功率為130 W進行優化試驗。

料液比1∶2、超聲波功率130 W固定不變，超聲時間對糯米全粉凝膠tanδ的影響如圖1B所示，糯米全粉凝膠的tanδ隨超聲時間的延長先增大后減小，在10 min時達到最大值，為0.75。隨著超聲處理時間的延長，超聲波的空化作用加強，對淀粉顆粒與蛋白質之間聯結及作用力的破壞程度增強，導致凝膠體系黏彈性下降，故選擇超聲時間為10、20、30 min進行優化試驗。

超聲波功率130 W、超聲時間5 min固定不變，料液比對糯米全粉凝膠tanδ的影響如圖1C所示，隨用水量增加至料液比為1∶10時tanδ最低，這可能是用水量增加到一定程度，料液翻動程度加劇，超聲波產生的氣流剪切作用加強，使得凝膠體系的黏彈性下降。tanδ在料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8時變化不大（約0.74），為減少用水量，故選擇料液比為1∶2、1∶4、1∶6進行優化試驗。

圖1 單因素對糯米全粉凝膠tan δ的影響Fig. 1 Single factors of variables on tan δ of waxy rice flour gel

2.1.2 正交試驗結果

由表2可知，各因素對糯米全粉凝膠的tanδ影響的主次順序為A＞C＞B，考慮節省時間，確定最優組合為A1B2C1，即超聲波功率130 W、超聲時間20 min、料液比1∶2。在最優工藝條件下進行3 次重復驗證實驗，糯米全粉凝膠tanδ平均值為0.82。通過方差分析（表3）可知，超聲波功率和料液比對糯米全粉凝膠的tanδ有極顯著影響，而超聲時間對其有顯著影響。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance for the effect of variables on tan δ of waxy rice flour gel and significance test

2.2 超聲波處理對糯米全粉特性的影響

2.2.1 糯米全粉的微觀結構

由圖2A可知，原糯米全粉（waxy rice flour，WRF）淀粉顆粒在蛋白質基質作用下發生團聚，形成直徑為30～70 μm的聚集體。由圖2B可知，UT-WRF淀粉顆粒分散分布，蛋白質基質呈片狀散落，仍有少數淀粉顆粒聚集，淀粉顆粒完整獨立，呈現出典型糯米淀粉顆粒的多角形態，粒徑為3～8 μm[15]。

圖2 糯米全粉掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 Scanning electron micrographs of raw and ultrasonic-treated waxy rice flour

2.2.2 糯米全粉的糊化特性

由表4可知，與WRF相比，UT-WRF的糊化溫度無顯著性變化，UT-WRF的峰值黏度、谷值黏度、最終黏度、崩解值和回生值均顯著升高（P＜0.05），這可能是因為WRF經過超聲波處理后，蛋白質與淀粉顆粒之間的結合變得松散，有利于水分子進入，增加了淀粉顆粒與水分子接觸，使得淀粉在糊化過程中充分吸水膨脹，易于糊化并能夠完全糊化[20]。

表4 糯米全粉的糊化特性Table 4 Pasting properties of raw and ultrasonic-treated waxy rice flour

2.2.3 超聲波處理對糯米全粉凝膠特性的影響

2.2.3.1 糯米全粉凝膠的凍融穩定性

析水率表示糯米全粉凝膠的凍融穩定性，析水率低表示凍融穩定性較好。由圖3可知，WRF凝膠與UT-WRF凝膠的析水率均隨著凍融循環次數的增加而逐漸增大，但在同一凍融循環次數下WRF凝膠與UT-WRF凝膠的析水率無顯著差異（P＞0.05），表明超聲波處理對糯米全粉形成凝膠的凍融穩定性沒有顯著影響。

圖3 糯米全粉凝膠析水率Fig. 3 Syneresis rates of raw and ultrasonic-treated waxy rice flour gels after repeated freeze-thaw cycles

2.2.3.2 糯米全粉凝膠的流變學性質

由圖4可知，UT-WRF凝膠的G’和G’’均小于WRF凝膠，UT-WRF凝膠G’與WRF凝膠G’’較為接近；UT-WRF凝膠G’與G’’差值小于WRF凝膠。Zhan Qian等[21]發現去除所有淀粉顆粒相關蛋白后，糯米全粉凝膠的G’和G’’均下降。由圖5可知，WRF凝膠與UT-WRF凝膠的tanδ均小于1，UT-WRF凝膠的tanδ大于WRF凝膠，兩種凝膠tanδ的差值約為0.14，這說明經過超聲處理后糯米全粉凝膠體系的彈性下降、黏性增強，凝膠性變弱。

圖4 糯米全粉凝膠的動態模量曲線Fig. 4 Dynamic modulus curves of waxy rice flour gels

圖5 糯米全粉凝膠的黏彈性流變曲線Fig. 5 Viscoelastic rheological curves of waxy rice flour gels

2.2.3.3 糯米全粉凝膠的質構性質

由表5可知，與WRF凝膠相比，UT-WRF凝膠的硬度、回復力、彈性和膠著性均顯著下降，而黏附性顯著增大（P＜0.05），說明經超聲波處理后糯米全粉的凝膠強度顯著下降，糯米全粉凝膠趨于呈現軟凝膠性質。

表5 糯米全粉凝膠的質構特性Table 5 Texture parameters of waxy rice flour gels

2.3 超聲波處理對糯米全粉凝膠特性的影響機制

2.3.1 超聲波處理對糯米淀粉特性的影響

2.3.1.1 糯米淀粉的微觀結構

如圖6A所示，從WRF中提取的淀粉（starch isolated from waxy rice flour，S-WRF）顆粒較小，顆粒直徑為3～8 μm，顆粒表面光滑，多數呈棱角分明的多角狀[15]，如圖6B所示，從UT-WRF中提取的淀粉（starch isolated from ultrasound treated waxy rice flour，S-UT-WRF）顆粒形貌、大小與S-WRF相比均無明顯變化，且顆粒結構完整，說明超聲波處理并沒有對糯米淀粉顆粒的形貌結構產生破壞。

圖6 糯米淀粉掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 Scanning electron micrograph of waxy rice starch

2.3.1.2 糯米淀粉的糊化特性

由表6可知，S-WRF和S-UT-WRF的糊化溫度、谷值黏度、最終黏度均無顯著差異（P＞0.05），S-UTWRF的峰值黏度、崩解值與回生值均較S-WRF顯著增大（P＜0.05），說明超聲波處理糯米全粉時對淀粉的吸水溶脹特性有一定影響。

表6 糯米淀粉的糊化特性Table 6 Pasting properties of waxy rice starch

2.3.1.3 超聲波處理對糯米淀粉凝膠特性的影響

由圖7可知，S-WRF與S-UT-WRF的析水率均隨凍融循環次數的增加而增大（P＜0.05），但相同凍融循環次數下S-WRF與S-UT-WRF的析水率無顯著差異（P＞0.05），說明S-WRF與S-UT-WRF的凍融穩定性無顯著差異。結合圖3可知，糯米全粉的析水率高于糯米淀粉，說明糯米淀粉凝膠的凍融穩定性比糯米全粉凝膠好，可能是由于冷凍處理對糯米全粉中蛋白質的形態結構影響較大，在凍融循環過程中蛋白質不能恢復到原來的狀態而失去持水性，造成糯米全粉凝膠的凍融穩定性比糯米淀粉差[22]。

圖7 糯米淀粉的析水率Fig. 7 Syneresis rate of waxy rice starch

由圖8可知，S-UT-WRF凝膠與S-WRF凝膠的G’和G’’均無明顯差異，糯米淀粉凝膠的G’和G’’與UT-WRF凝膠接近，說明糯米全粉經過超聲波處理后其凝膠特性趨向于糯米淀粉的凝膠特性。由圖9可知，S-UT-WRF凝膠的tanδ大于S-WRF凝膠，但差值很小，約為0.04，說明超聲波處理對糯米淀粉凝膠的彈性和黏性影響很小。

圖8 糯米淀粉凝膠的動態模量曲線Fig. 8 Dynamic modulus curve of waxy rice starch gel

圖9 糯米淀粉凝膠的黏彈性流變曲線Fig. 9 Viscoelastic rheological curve of waxy rice starch gel

由表7可知，S-WRF凝膠與S-UT-WRF凝膠的硬度、黏附性、回復力、內聚性、彈性和膠著性均無顯著差異（P＞0.05），說明在超聲波處理糯米全粉過程中，并沒有對糯米淀粉產生破壞。結合表5分析可知，糯米全粉凝膠的硬度、回復力、彈性均大于糯米淀粉凝膠，說明糯米全粉中的蛋白質能夠增強凝膠強度[23]。

表7 糯米淀粉凝膠的質構特性Table 7 Texture parameters of waxy rice starch gel

2.3.2 超聲波處理對糯米蛋白質特性的影響

2.3.2.1 糯米蛋白質的微觀結構

由圖10可知，從WRF中提取的蛋白質（protein extracted from waxy rice flour，P-WRF）呈致密塊狀結構，從UT-WRF中提取的蛋白質（protein extracted from ultrasound treated waxy rice flour，P-UT-WRF）結構松散，孔洞密集。這可能是由于超聲波的空化效應產生了局部超高壓和高頻振動[24]，改變了蛋白質的高級構象，使蛋白質結構變得松散。

圖10 糯米蛋白掃描電子顯微鏡圖Fig. 10 Scanning electron micrograph of waxy rice protein

2.3.2.2 糯米蛋白質的二級結構

將糯米蛋白的酰胺I帶圖譜作二階導數并同時進行高斯擬合（圖11），計算各二級結構對應子峰積分面積，得到二級結構相對含量。由表8可知，P-UT-WRF二級結構中β-折疊與無規卷曲相對含量顯著上升（P＜0.05），而α-螺旋與β-轉角相對含量則顯著下降（P＜0.05），說明超聲波處理破壞了蛋白質分子間的相互作用并影響了蛋白質分子結構[25]。

圖11 傅里葉變換紅外光譜分析糯米蛋白質二級結構Fig. 11 FT-IR spectra and fitting of amide I bands of waxy rice protein

表8 糯米蛋白質的二級結構相對含量Table 8 Secondary structure content of waxy rice protein%

2.3.2.3 糯米蛋白質的二硫鍵含量

由表9可知，與P-WRF相比，P-UT-WRF的游離巰基含量顯著上升（P＜0.05），二硫鍵含量顯著下降（P＜0.05）。這是由于超聲波的空化作用使蛋白質分子間或分子內的二硫鍵斷裂[26]，二硫鍵斷裂后形成新的游離巰基[27]。二硫鍵含量下降會導致糯米蛋白質的剛性減弱[28]。

表9 糯米蛋白質的游離巰基與二硫鍵含量Table 9 Free sulfhydryl and disulfide bond contents of waxy rice protein

2.3.2.4 糯米蛋白質的熱特性

蛋白質分子的熱穩定性可通過熱變性溫度（Td）與焓變（ΔH）反映，Td與ΔH越小，蛋白質有序程度越低、結構越不穩定，使其完全變性需要的能量就越小[29]。如表10所示，P-WRF的Td為165.31 ℃、ΔH為138.47 J/g，P-UT-WRF的Td為147.56 ℃、ΔH為123.63 J/g，表明P-UT-WR的熱穩定性顯著下降。

表10 糯米蛋白質的熱力學特性Table 10 Thermodynamic properties of waxy rice protein

糯米全粉的凝膠特性由其中組分的含量、結構、特性及其相互作用決定。已有報道指出糯米全粉中蛋白質含量對糯米全粉及其制品的凝膠特性有顯著影響[13,30-32]。本研究結果表明，應用超聲波處理不改變其中淀粉的結構和特性，也不改變糯米全粉中蛋白質含量，而是通過改變蛋白質的構象而改變淀粉和蛋白質的相互作用，從而改變糯米全粉的凝膠特性。

3 結 論

通過單因素和正交試驗可知，在超聲波功率130 W、料液比1∶2，超聲時間20 min條件下制備的UT-WRF凝膠tanδ最高，為0.82。經超聲波處理后，糯米全粉凝膠的黏性顯著提高，表現出較好的軟凝膠特性。分析經超聲波處理的糯米全粉中兩大組分淀粉和蛋白質特性發現，超聲波處理改變了糯米全粉中蛋白質的形態和分子結構，使蛋白質發生解聚，蛋白質基質結構變得松散；超聲波處理對糯米全粉中淀粉的顆粒結構和特性未產生顯著影響，表明超聲波處理糯米全粉時，主要是通過改變其中蛋白質的構象而改變全粉的凝膠特性。