艷山姜果實質量標準研究

謝澤碧，洪影雯，梁子寧，盧 瑩，羅 敏，韋麗翠

（廣西中醫藥大學，南寧 530001）

艷山姜［Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith］別名有假砂仁、草豆蔻、大良姜、土砂仁等［1，2］，習慣藥用部位是其成熟干燥的果實，性溫，味辛、澀，歸于肺、大腸、脾和胃經［3］，功效有溫中、行氣、燥濕、止痛、截瘧等［4］，可以用來治療胃脘脹痛、胸腹脹滿、脾胃虛弱、腸鳴泄瀉、瘧疾等疾病［5］。多分布在中國東南部及西南部地區，習慣生長在海拔100～1 000 m的溪邊叢林及草叢、闊葉林中［6，7］。目前，從艷山姜中分離出來的化學成分多達200余種，主要為揮發油、黃酮、甾體類和有機酸類等組分［8-13］。

目前，對艷山姜的研究主要集中在葉、根、莖的性狀［14］、多糖提取［15］及揮發油等方面［16-19］，鮮見果實質量標準方面的報道。此外，還有報道稱艷山姜果實主要的藥理活性成分為揮發油，但究竟為蒎烯、乙酸龍腦酯還是黃酮類等化合物起作用還是綜合成分起作用并不明確，因此本研究對艷山姜進行觀察鑒別、常規性檢查、浸出物含量測定以及揮發油含量的測定，以期為艷山姜果實在臨床用藥中能做到安全、有效、可控，以及質量標準的建立奠定試驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥及試劑藥材采自廣西壯族自治區（以下簡稱廣西）多個產地（表1），共11個批次，分別編號為YSJ-1至YSJ-11，其中YSJ-3為對照藥材。經廣西中醫藥大學藥用植物教研室韋松基教授鑒定為姜科植物艷山姜的成熟果實。

表1 艷山姜果實采集信息

乙酸龍腦酯、乙酸乙酯、甲醇、無水乙醇等均為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器ZF-20C型暗箱三用紫外分析儀（上海精密儀器儀表有限公司）；EclipseE200MV型尼康生物顯微鏡（南京橫橋儀器有限公司）；GC7890A型氣相色譜儀、MS5975C型質譜儀（美國Agilent科技公司）；揮發油提取器、中藥粉碎機等。

1.2 方法

1.2.1 藥材性狀鑒別艷山姜成熟果實為蒴果（圖1），具明顯粗毛，呈類球形，長1.0～2.5 cm，直徑1.0～2.5 cm，有12～18條隆起；頂端常有宿存花被，底部有果梗；果皮棕色或黃棕色，皮薄、較軟，一層白色隔膜把果皮和種子分隔開成3瓣，每瓣有3～8顆種子；種子易散落、呈不規則多邊體，直徑0.3～0.5 cm，表面有白色的薄膜，撥開薄膜呈黑色、表面光滑、較硬，斷面有油性，氣微芳香、味微辛。

圖1 艷山姜果實

1.2.2 橫切片顯微鑒別艷山姜果實橫切片呈圓形（圖2），表面有許多毛茸，多為非腺毛，紅棕色為主，基本薄壁組織中有較多的油細胞（圖3），其胞腔具棕黃色油滴，其他薄壁細胞內可見較小的草酸鈣方晶和淀粉粒；維管束分散排列在果皮薄壁組織中，20～25個維管束呈同心環狀，整個切片具2～3個同心環。由圖2可知，果實為3心皮，3個子房室，中軸胎座，每室3～8顆種子不等。

圖2 艷山姜果實橫切片

圖3 艷山姜果實顯微結構

1.2.3 粉末顯微鑒別艷山姜果實粉末顯微特征見圖4。樣品粉末呈棕色或棕黃色，纖維較多、單個或成束、頂端較鈍，長750～405 μm。非腺毛眾多，單細胞、多細胞均有散在，長約80～390 μm。石細胞較多，單個或成團，呈多邊形，長約35～350 μm，寬約20～235 μm。可見內、外果皮，且外果皮上具非腺毛的短痕。淀粉粒較少，常呈單粒或復粒，多為類圓形，大小約0.5～25.0 μm。草酸鈣方晶較少，長約0.5～15.0 μm，寬約0.5～10.0 μm。螺紋導管較少，直徑約1.1～3.5 μm。

圖4 艷山姜果實粉末顯微特征

1.2.4 不同批次艷山姜藥材揮發油含量測定稱取艷山姜果實50 g，利用中藥粉碎機適當粉碎至種子破裂，在圓底燒瓶中裝入粉碎后的艷山姜果實和500 mL蒸餾水，連接揮發油提取器。從冷凝管上部添加蒸餾水直到沒過揮發油提取器的刻度部分，保持混合液微沸狀態5～6 h，直至油量停止增加，則停止加溫，待稍冷卻后收集揮發油。參考《中國藥典（四部）》揮發油測定法［20］，測定11批藥材的揮發油含量。

1.2.5 艷山姜揮發油對照品溶液制備用分析天平分別精密稱取乙酸龍腦酯5 μL、3.00 g作對照品，對應加入無水乙醇0.5、10.0 mL，制成10 μL∕mL的對照品溶液①和0.3 g∕mL對照品溶液②。

1.2.6 艷山姜揮發油供試品溶液制備精密稱取11批藥材粉末各1 g，分別加入甲醇5.0 mL，超聲處理10 min后進行提取、過濾，取上清液置于2 mL容量瓶，制成供試品溶液①。分別量取11批藥材揮發油100 μL，用乙酸乙酯稀釋，定容至10 mL容量瓶中，即得供試品溶液②。

1.2.7 GC-MS儀器聯用

1）色譜條件。HP-5MS石英毛細管柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫：初始溫度50℃，以5℃∕min升溫至120℃，保持2 min，以6℃∕min升溫至260℃。運行時間為43 min。柱流量：1 mL∕min。柱溫100℃，進樣口溫度250℃，檢測器（FID）溫度250℃，分流比為10∶1。

2）溶液制備。參照“1.2.6”對照品溶液②、供試品溶液②方法制備。

2 結果與分析

2.1 薄層鑒別

參考2015年版中國藥典（四部）通則（0502）薄層色譜法，用移液槍吸取對照品溶液①、供試品溶液①各6 μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以環己烷-氯仿-乙酸乙酯（13-2-2）作展開劑。取出晾干后，在365 nm處觀察（圖5），結果表明，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且斑點顯色清晰集中。

圖5 11批艷山姜果實粉末薄層色譜

2.2 檢查

2.2.1 水分參考《中國藥典（四部）》（通則0832）方法進行水分測定［20］，11批艷山姜藥材水分為6.93%～15.72%（表2），多數在11%以下，初步擬定艷山姜果實藥材水分不得超過15.0%。

2.2.2 總灰分、酸不溶性灰分參考《中國藥典（四部）》（通則2302）方法進行總灰分和酸不溶性灰分測定［20］，11批艷山姜藥材總灰分范圍為5.35%～6.80%，均在7.0%以下，結合實際應用考慮，初步擬定總灰分不得超過8.0%。試驗發現酸不溶性灰分為0.93%～1.81%，大部分在1.5%以下，初步擬定酸不溶性灰分不得超過1.9%（表2）。

2.2.3 醇溶性浸出物參考《中國藥典（四部）》（通則2201）方法進行醇溶性浸出物測定［20］，11批次艷山姜藥材的浸出物含量為5.65%～12.17%（表2），均在5.5%以上，結合實際應用考慮，初步擬定醇溶性浸出物不得低于5.0%。

表2 11批艷山姜藥材的檢查項測定結果（n=3）（單位：%）

2.2.4 膨脹度參考《中國藥典（四部）》（通則2101）的膨脹度測定法［20］，以無水乙醇做溶劑，3個批次艷山姜藥材的膨脹度為2.89～3.74 mL∕g（表3），結合實際應用考慮，初步擬定艷山姜藥材膨脹度不得低于2.80 mL∕g。

表3 艷山姜膨脹度測定結果（n=3）

2.3 揮發油含量測定與分析

2.3.1 含量測定參考《中國藥典（四部）》（通則2204）揮發油測定法［20］，測定11批藥材的揮發油含量（表4）。11批艷山姜藥材平均揮發油含量范圍為0.85%～1.32%，均在0.80%以上；大部分在1.00%以上（包括1.00%）；11處產地艷山姜藥材揮發油的平均含量為1.04%；因此，結合實際應用考慮，擬定揮發油含量不得少于0.80%。

表4 11批艷山姜藥材揮發油含量 （單位：%）

2.3.2 GC-MS聯用分析對11批藥材使用GC-MS儀進行分析，通過色譜峰面積歸一化法，定量分析揮發油中的11個含量較高、相對百分含量靠前的化學成分（表5）。

表5 不同產地艷山姜果實揮發油的主要化學成分及相對含量

經GC-MS儀器聯用，測定11批艷山姜果實揮發油，結果表明，β-蒎烯成分相對含量最高，其次是檜烯和桉葉油醇等。據文獻報道，β-蒎烯藥理作用有消炎抗菌、抗氧化、抗癌、抗痙攣、抗抽搐等作用［20］；水芹烯具有殺弧菌、鎮痛消炎、抑菌等功效［21，22］；α-蒎烯具有潤肺下氣、化痰止咳、消炎抗菌等功效［23-25］，即3種主要化學成分與艷山姜果實的功效主治具有一定相關性。

由測定分析可知，艷山姜果實揮發油中乙酸龍腦酯含量低，故根據文獻［26］，艷山姜與其他姜科植物不同，薄層鑒別中以其作為定性指標的選擇還需進一步考察。

3 小結與討論

通過對廣西多地的艷山姜果實藥材進行性狀、顯微鑒別和薄層色譜鑒別，發現其鑒別特征均明顯、穩定，可作為艷山姜果實藥材的鑒別依據。

前期預試驗考察了多種展開系統、點樣方式、多種顯色劑、藥材取樣量、多種吸附劑及環境溫濕度，得出了穩定且可靠的薄層鑒別方法。在本研究的薄層色譜試驗中，以環己烷-氯仿-乙酸乙酯（13-2-2）為展開劑，在波長365 nm處觀察，發現色譜分離度好、斑點清晰，斑點色彩層次分明。對11批艷山姜藥材水分、灰分及浸出物等進行測定，依據試驗結果，建議本品含水量限度不超過15.0%；總灰分限度不超過8.0%；酸不溶性灰分限度不超過1.9%；醇溶性浸出物限度不少于5.0%；膨脹度不低于2.80 mL∕g。

不同產地艷山姜藥材揮發油含量有較大差異，廣西11處產地艷山姜果實藥材揮發油的平均含量為1.04%。因不同的生產地和不同的采收時間藥材揮發油含量不同，結合實際應用考慮，建議按干燥品計算，揮發油含量不低于0.80%。文獻報道艷山姜揮發油具有顯著的抗炎鎮痛、調節血脂、抗氧化作用［27］，可以作為艷山姜果實基于生物效應組分的質控標準之一。由GC-MS儀器聯用分析可知，艷山姜果實揮發油主要由β-蒎烯、檜烯、桉葉油醇、蒎烯等化學成分組成，乙酸龍腦酯含量較低，在前期薄層鑒別中以其作為定性指標的選擇還需進一步考察。

綜上，本研究方法簡便易行、復現性較好、特征明顯、無干擾、耐用性強，可以作為艷山姜果實藥材的鑒別方法，有利于其臨床用藥的安全、有效、可控，并為提升艷山姜的質量標準提供科學依據。