不同輸精方式和有效精子數量對吉林馬情期受胎率的影響

劉曉輝，譚成成，張鵬舉，王偉霞，樸慶林，李信濤，郎洪彥

（吉林省農業科學院動物生物技術研究所，吉林 公主嶺 136100）

吉林馬是通過引進前蘇聯重型馬（阿爾登、蘇重挽、弗拉基米爾等）和輕型馬（頓河、蘇高血、卡巴金等）與本地馬雜交改良，經過28年的聯合育種，于1978年成功培育出的挽乘兼用型和重挽型的新品種［1］，具有力速兼備、適應性強、耐粗飼、持久力強等特性。吉林馬目前存欄量約1.5萬匹，數量急劇減少，利用優良吉林馬種公馬精液與人工授精技術相結合是增加其繁殖數量、培育新群體的最有效方法之一。

近年來，隨著人民生活方式的轉變，現代馬業再次興起，賽馬、休閑娛樂、肉用、乳用及生物制品的開發與利用成為馬產業主要的發展方向，因此，馬匹的改良與繁育變得尤為重要，亟需引進新技術與之相適應［2-6］。子宮角深部輸精技術是將精液輸送至排卵側子宮角處，從子宮頸口至排卵側子宮角約25 cm進行適度深部輸精，可以降低輸入的有效精子數量，提高優良種公馬利用率，加快馬群良種化進程［7，8］。張發憲［9］報道采用子宮角深部輸精技術可以顯著提高母馬的受胎率，但還缺乏比較系統的研究數據。本文系統研究不同輸精方式及不同有效精子數量對吉林馬情期受胎率的影響，以期為提高馬人工受精技術水平，加速吉林馬品種改良進程提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

種公馬來自吉林省松原市欣興牧業馬場。選擇4匹4～12歲成年吉林馬種公馬，要求其體格健康無疾病、繁殖性能良好，按《種公馬飼養標準》（DBN654000∕T216—2015）要求方法飼養。采精時間為每年4—7月。選擇吉林馬母馬300匹，母馬年齡為4～10歲，體格健康無繁殖疾病，發情周期正常，每天保證充足的飼草、水和光照。

1.2 主要試劑及儀器

果糖、Tris、檸檬酸購自生工生物工程（上海）股份有限公司；青霉素和鏈霉素為獸用商店購買；卵黃液為實驗室自備。

離心機（型號為TDL80-2D），購自上海安亭科技儀器廠；鼓風干燥箱（型號為PH-140A），購自上海一恒科學儀器有限公司；邁朗全自動精子分析儀（型號為ML-210JZ），購自南寧松景天倫生物科技有限公司；一次性輸精管（廣西蔣氏動物用品有限公司）、一次性子宮角輸精管（上海法國卡蘇科技有限公司）。

1.3 馬精液制備

1.3.1 馬精液稀釋液的配制準確稱取Tris 3.028 g、檸檬酸1.692 g、果糖1.250 g，加入蒸餾水充分溶解、煮沸，室溫冷卻后，4℃保存。

1）卵黃液制備。取新鮮雞蛋，酒精棉球擦拭蛋殼表面滅菌，去除蛋清，刺破卵黃膜，收集卵黃液體。

2）馬精液稀釋液組成。基礎液（40+10）mL卵黃液+雙抗，置于37℃水浴鍋中備用。

1.3.2 精液的采集采精時，用溫水清洗種公馬陰莖，挑選性情溫順的發情母馬做臺馬或使用假臺馬。采精人員安裝好假陰道，固定好集精杯，通過注水口灌注40℃左右的溫水，檢查密閉性，采精時保證水溫為38～40℃。待公馬爬跨時，采精人員迅速站到臺馬右后側，將陰莖導入假陰道內，完成采精。采精后，將集精杯緩緩向下傾斜，打開放氣閥門，取下集精杯，迅速送至精液處理室，用滅菌紗布過濾精液并統計采精量。原精顏色為不透明乳白色，無異常氣味，精子活力達0.6以上，密度在1.0×109個∕mL的精液才能使用。

1.3.3 精液的稀釋用全自動精子分析儀對試驗精液進行活力和密度檢測。對試驗馬精子密度和精子活力計算后進行稀釋，使其分別含有10×108、5×108、2×108、1×108、0.75×108、0.5×108、0.25×108、0.125×108個不同有效精子數量，分裝后備用。

1.4 輸精方法

由熟練掌握輸精技術的人員進行人工輸精，A組采用子宮體常規輸精，將輸精管過子宮頸口，進行子宮體輸精，見圖1。B組采用子宮角深部輸精，子宮角深部輸精是將精液輸送至排卵側子宮角處約25 cm，進行適度深部輸精，見圖2。

圖1 子宮體常規輸精部位

圖2 子宮角深部輸精部位

1.5 試驗設計

通過直腸檢查法檢測母馬發情狀況，每天進行一次發情排卵鑒定。將發情母馬隨機分為2組，A組為子宮體常規輸精組（n=150），B組為子宮角深部輸精組（n=150）。A組繼續分為A1組（n=30，輸精量30 mL含10×108個有效精子數）、A2組（n=30，輸精量20 mL含5×108個有效精子數）、A3組（n=30，輸精量10 mL含2×108個有效精子數）、A4組（n=30，輸精量5 mL含1×108個有效精子數）、A5組（n=30，輸精量2 mL含0.5×108個有效精子數）；B組繼續分為B1組（n=30，輸精量5 mL含1×108個有效精子數）、B2組（n=30，輸精量3 mL含0.75×108個有效精子數）、B3組（n=30輸精量2 mL含0.5×108個有效精子數）、B4組（n=30，輸精量1 mL含0.25×108個有效精子數）、B5組（n=30輸精量0.5 mL含0.125×108個有效精子數）。

1.6 統計分析方法

試驗數據使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，均用平均值±標準差（x±s）表示，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 子宮體一次輸精有效精子數量對吉林馬情期受胎率的影響

由表1可知，采用子宮體輸精方式一次輸精不同有效精子數量進行人工授精后，根據吉林馬母馬情期受胎率統計情況，試驗A1、A2組比A3組情期受胎率稍有提高，但差異不顯著（P＞0.05）；當有效精子數量是A3組的50%（A4組）和25%（A5組）時，母馬情期受胎率分別降低了20.35和33.37個百分點，差異顯著（P＜0.05）。這說明子宮體一次輸精有效精子數在2.0×108～10.0×108個時并不影響母馬的情期受胎率，但降低到0.5×108～1.0×108個時顯著影響母馬的情期受胎率。

表1 子宮體一次輸精不同有效精子數量母馬情期受胎率

2.2 子宮角一次輸精有效精子數對吉林馬情期受胎率的影響

由表2可知，采用子宮角輸精方式一次輸精不同有效精子數量進行人工授精后，根據吉林馬母馬情期受胎率統計情況，試驗B1、B2組比B3組情期受胎率稍有提高，但差異不顯著（P＞0.05）；當有效精子數量是B3組的50%（B4組）和25%（B5組）時，吉林馬母馬情期受胎率分別降低了15.62和24.97個百分點，差異顯著（P＜0.05）。這說明子宮角一次輸精有效精子數在0.50×108～1.00×108時并不影響母馬的情期受胎率，但降低到0.125×108～0.250×108時顯著影響母馬的情期受胎率。

表2 子宮角一次輸精不同有效精子數量母馬情期受胎率

2.3 不同輸精方式對吉林馬情期受胎率的影響

由表3可知，吉林馬母馬子宮角深部輸精平均情期受胎率（69.80%）顯著高于子宮體常規輸精受胎率（45.78%）（P＜0.05）。采用子宮角深部輸精能顯著提高吉林馬母馬情期受胎率，顯著降低一次輸精有效精子數量，提高種公馬精液利用效率，具有重大的生產意義。

表3 不同輸精方式吉林馬母馬情期受胎率

3 討論

關于輸精有效精子數量的研究，在驢［10］、牛［11］、羊［12］、豬［13］等已有報道，但關于馬一次輸精有效精子數量的研究目前國內還無報道。本研究結果表明，10×108個和5×108個有效精子數量組的吉林馬母馬情期受胎率略高于2×108個有效精子數量，說明增加有效精子數量，可以提高母馬的受胎率，但差異并不顯著。當有效精子數量減少至1×108個和0.5×108個時，母馬情期平均受胎率分別下降了20.35、33.37個百分點。Oliveria等［14］研究了有效精子數量對母驢情期受胎率的影響，發現在子宮體輸精的情況下，輸入的有效精子數量為10×108個時受胎率為73%，當有效精子數量減少至5×108個時受胎率則下降到40%，與本試驗結果有一定差距，可能是驢人工輸精需要比馬更多的有效精子數量才能保證受胎率。在子宮角深部輸精試驗中，同樣驗證了此結果。

Oliveria等［15］研究了冷凍精液不同輸精方式對母驢情期受胎率的影響，結果子宮體輸精方式情期受胎率為0%，而子宮角輸精方式情期受胎率為28.26%。楊莉等［16］研究了新鮮精液不同輸精方式對母驢情期受胎率的影響，結果表明子宮體輸精方式情期受胎率為33.33%，而子宮角輸精方式情期受胎率為45.16%。付靜濤等［17］研究了常規輸精和深部輸精對馬情期受胎率的影響，結果子宮角深部輸精情期受胎率為65.72%，而子宮體常規輸精情期受胎率為56.13%，說明子宮角深部輸精能顯著提高母馬情期受胎率。本試驗結果說明，與子宮體常規輸精相比，子宮角深部輸精能顯著提高母馬的情期受胎率。這一結果可能與輸精的部位有關，深部輸精將精液輸送至子宮角前1∕3處，使精液快速到達子宮角，從而快速與卵子結合，完成受精過程，進而提高了母馬的受胎率。

種公馬的使用年限一般為12～15年，在使用年限內應該更好地發揮其使用效率，最大限度提高種公馬的繁殖力。隨著現代馬業的迅速發展，馬冷凍精液的使用越來越受到關注，冷凍精液的使用使種公馬的繁殖能力大大提高［18］，采用冷凍精液人工授精技術，一匹種公馬一年可以配種達萬匹以上。如果把每一劑量凍精有效精子數量從現在的（1～2）×108個降低至0.5×108個，凍精產量就能提高50%，如果每匹種公馬年平均生產凍精20 000劑，通過降低有效精子數量，一年可多生產凍精10 000劑，大大提高優良種公馬的使用效率。

4 結論

子宮體常規輸精一次有效精子數達2×108個以上或子宮角深部輸精一次有效精子數達0.5×108個以上，吉林馬母馬情期受胎率可達60.00%以上；采用子宮角深部輸精方式能顯著提高吉林馬母馬的情期受胎率，對吉林馬乃至整個馬業生產具有重大意義。