科學(xué)家揭開(kāi)植物經(jīng)典PIN家族蛋白結(jié)構(gòu)面紗

擬南芥PIN1蛋白三種狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制示意圖（資料來(lái)源：課題組）

向日葵為什么總是向著太陽(yáng)？在植物體內(nèi)有一種稱為生長(zhǎng)素的物質(zhì)，如同人體內(nèi)生長(zhǎng)激素一樣，它負(fù)責(zé)給細(xì)胞傳達(dá)信息，指揮植物的生長(zhǎng)發(fā)育。受光照影響，生長(zhǎng)素會(huì)從向日葵莖端向光側(cè)運(yùn)輸?shù)奖彻鈧?cè)，產(chǎn)生濃度差異。由此，背光側(cè)生長(zhǎng)會(huì)更快一些，而向光側(cè)慢一些，向日葵的花盤(pán)自然就朝向太陽(yáng)。

生長(zhǎng)素的運(yùn)輸需要細(xì)胞膜上的“搬運(yùn)工”——轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助，其中非常重要的一員是負(fù)責(zé)將生長(zhǎng)素從細(xì)胞內(nèi)搬運(yùn)到細(xì)胞外的PIN家族蛋白。這些“搬運(yùn)工”長(zhǎng)什么樣？又是如何工作的？

8月2日，《自然》雜志上以“快速通道”形式發(fā)表了中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部孫林峰教授團(tuán)隊(duì)在植物生長(zhǎng)機(jī)理上的重大進(jìn)展，揭示了生長(zhǎng)素“搬運(yùn)工”成員PIN1蛋白，以及它分別與抑制劑NPA（又名抑草生）、生長(zhǎng)素IAA結(jié)合的三個(gè)高分辨率結(jié)構(gòu)，并通過(guò)功能分析闡釋了PIN1“搬運(yùn)”生長(zhǎng)素的機(jī)制，為理解植物生長(zhǎng)素運(yùn)輸調(diào)控以及針對(duì)PIN家族蛋白的農(nóng)業(yè)用除草劑和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)提供了重要基礎(chǔ)。

中國(guó)科大生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部孫林峰教授團(tuán)隊(duì)部分成員合影

亟待解決的科學(xué)問(wèn)題

作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的植物激素，生長(zhǎng)素幾乎參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的每個(gè)過(guò)程，如胚胎發(fā)育、向光性和向重力性生長(zhǎng)等。生長(zhǎng)素一個(gè)顯著特點(diǎn)是其細(xì)胞間傳遞具有方向性，被稱為極性運(yùn)輸，而PIN家族蛋白在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

特定PIN家族成員在細(xì)胞質(zhì)膜上具有不對(duì)稱分布的特點(diǎn)，它們的分布位置決定了生長(zhǎng)素“搬運(yùn)”的方向。但是由于缺乏精細(xì)的三維結(jié)構(gòu)，PIN家族蛋白特異性識(shí)別、轉(zhuǎn)運(yùn)生長(zhǎng)素的機(jī)制一直未知。

NPA是之前在實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用的一種生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最早作為除草劑應(yīng)用的化學(xué)小分子之一。它可以直接靶向PIN家族蛋白，但是如何發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚。

孫林峰教授在指導(dǎo)團(tuán)隊(duì)

解析PIN家族蛋白的三維結(jié)構(gòu)是生長(zhǎng)素研究領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。該結(jié)構(gòu)的揭示，不僅有助于理解生長(zhǎng)素的“搬運(yùn)”過(guò)程，同時(shí)基于這些結(jié)構(gòu)，有利于研究人員針對(duì)PIN家族蛋白設(shè)計(jì)小分子抑制劑，找到更高效、對(duì)環(huán)境更友好、對(duì)人類更安全的除草劑和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

此次研究中，孫林峰團(tuán)隊(duì)選擇了PIN家族中經(jīng)典的，也是最早鑒定出的PIN家族成員之一——擬南芥PIN1蛋白作為研究對(duì)象。

成功揭示PIN1蛋白結(jié)構(gòu)

第一步，需要證實(shí)PIN1蛋白確實(shí)可以運(yùn)輸生長(zhǎng)素。團(tuán)隊(duì)花了一年多時(shí)間，搭建出一套全新的、基于放射性同位素的功能檢測(cè)體系，驗(yàn)證了PIN1蛋白的生長(zhǎng)素“搬運(yùn)”活性，以及受激酶激活、被NPA抑制的過(guò)程。

第二步，表達(dá)和純化PIN1蛋白。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是需要獲取足量的適于結(jié)構(gòu)解析的蛋白樣品。這是最難的一步，因?yàn)镻IN1蛋白在植物體內(nèi)含量非常低，不能滿足實(shí)驗(yàn)過(guò)程中研究量的需求，因此需要借助于其他細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)蛋白進(jìn)行富集。

孫林峰教授和高永翔工程師在300 kV電鏡上樣間轉(zhuǎn)移樣品

從2017年建立起團(tuán)隊(duì)，開(kāi)始這項(xiàng)課題研究，一直到2021年，前四年的時(shí)間里，他們一直在摸索不同表達(dá)和純化、冷凍樣品制備等條件。最終利用哺乳動(dòng)物表達(dá)體系成功獲得了優(yōu)質(zhì)樣品。

第三步，利用冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)解析蛋白結(jié)構(gòu)。“冷凍電鏡相當(dāng)于蛋白分子的‘?dāng)z影師’，可以從不同角度給蛋白‘拍照’，然后利用這些二維照片重構(gòu)出三維結(jié)構(gòu)”，孫林峰作了一個(gè)類比。

“冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集借助了中國(guó)科大冷凍電鏡中心和中科院生物物理所生物成像中心提供的優(yōu)秀平臺(tái)，其中中國(guó)科大冷凍電鏡中心的300kV高端電鏡是2019年開(kāi)始安裝，2020年正式投入運(yùn)行，為團(tuán)隊(duì)結(jié)構(gòu)研究提供了‘利器’”。

但是PIN1蛋白“不穩(wěn)定”，并且分子量較小。如何使它們“變大”并保持一種相對(duì)靜止的狀態(tài)？團(tuán)隊(duì)與中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心李典范團(tuán)隊(duì)合作，篩選得到了靶向PIN1蛋白的納米抗體，并首次揭示了經(jīng)典PIN家族蛋白成員的三維結(jié)構(gòu)。

下一步，團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)研究PIN1蛋白的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，捕捉不同狀態(tài)下的三維結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步研究PIN1蛋白受磷酸化激活及調(diào)控的機(jī)理，更深入地理解PIN家族蛋白運(yùn)輸生長(zhǎng)素的機(jī)制。同時(shí)，基于三維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、篩選化學(xué)小分子，力圖發(fā)現(xiàn)更安全有效的除草劑或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，更好地服務(wù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。