黃瓜枯萎病拮抗菌Burkholderia gladioli L1-3的分離鑒定及防病促生效果

李亞莉 侯 棟 岳宏忠 張東琴 段艷巧

（甘肅省農業科學院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070）

黃瓜枯萎病又叫死秧病、蔓割病、萎蔫病，是一種土傳性病害，其病原菌為尖孢鐮孢菌黃瓜專化型（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum Owen）。尖孢鐮孢菌可以通過根毛及植株傷口處侵染，使黃瓜根莖部維管束變褐腐爛，病原菌進一步侵染繁殖后，可使整株枯萎死亡（曹云娥 等，2020）。化學農藥的大量使用以及長期使用同種農藥，致使病菌產生抗藥性，根際土壤中的有益微生物數量減少；同時化學農藥的大量使用還會對環境造成污染，危害人、畜健康（Wang et al.，2020）。培育抗病黃瓜新品種是防治枯萎病較安全的一種措施，但由于品種選育需要較長時間，實際生產中的抗病黃瓜品種并不多見。嫁接技術在黃瓜枯萎病的防治上應用最廣泛，但由于嫁接需要一定的技術，人工成本較高，且砧木對接穗果實風味有一定的影響，在一定程度上限制了嫁接技術的發展。常年種植同一種作物易使根際土壤微生物環境被破壞，有害微生物數量增加，土傳病害越來越嚴重（賈紅梅等，2020；劉會芳 等，2021）。利用有益拮抗微生物防治土傳病害，對環境無污染，對人畜無害，符合現代農業發展趨勢。

本試驗從甘肅省蘭州、武威、靖遠等地22 塊多年連作黃瓜的枯萎病發生地塊采集土樣，采用平板對峙法從分離純化的細菌中篩選拮抗菌株，基于形態特征、生理生化特性及基因序列分析進行菌株鑒定；然后測定拮抗菌株的抑菌譜，并通過盆栽試驗評價其對黃瓜枯萎病的防病促生效果，以期為蔬菜病害生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜品種為甘豐袖玉，由甘肅省農業科學院蔬菜研究所提供。

供試病原菌為尖孢鐮孢菌黃瓜專化型（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum Owen）、辣椒腐霉菌（Pythium spinosum）、辣椒灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、辣椒立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、茄鏈格孢（Alternaria solani）、尖孢鐮孢菌甜瓜專化型（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）、尖孢鐮孢菌西瓜專化型（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）、尖孢鐮孢菌十字花科專化型（Fusarium oxysporumSch1.f.sp.conglutinans），由中國農業科學院蔬菜花卉研究所、北京市農林科學院蔬菜研究所、甘肅省農業科學院植物保護研究所和本所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌株的分離鑒定 2021 年3 月，從甘肅省蘭州、武威、靖遠等地22 塊多年連作黃瓜的枯萎病發生地塊采集土樣，每份100 g，采集深度10～20 cm；分別裝入無菌自封袋，帶回本所實驗室，保存于-80 ℃的恒溫冰箱，用于拮抗菌的分離。

采用土壤稀釋法分離細菌。分別將22 份土樣充分混勻，隨機稱取10 g，加入90 mL 無菌水，置于搖床28 ℃、180 r·min-1振蕩30 min，此時菌懸液濃度為1×10-1g·mL-1；然后取1 mL 菌懸液，加入9 mL 無菌水，配制成濃度為1×10-2g·mL-1的菌懸液；依次類推，配制成濃度分別為1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7g·mL-1的菌懸液。分別取濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7g·mL-1的菌懸液0.2 mL，加入牛肉膏蛋白胨平板中，迅速混勻、倒置，每個濃度3 皿；28～30 ℃恒溫培養2～3 d，將單菌落劃線培養至純，保存于20%甘油中，放置于-80 ℃的恒溫冰箱保存。

拮抗菌株的篩選采用平板對峙法。在PDA 平板中央接種直徑7 mm 的拮抗菌菌餅，在距離拮抗菌菌餅2 cm 處接種病原真菌菌餅，以僅接種病原真菌菌餅為對照，每處理3 次重復，每重復3 皿；于28～30 ℃恒溫箱中培養3～5 d，當對照長滿整個平板后，測定抑菌帶寬度（抑菌圈直徑），篩選抑菌效果好的細菌菌株。初篩采用抑菌帶法，復篩采用抑菌圈法。

采用形態特征觀察、生理生化特性測定和多基因系統發育樹分析的方法，對拮抗菌株進行鑒定。將拮抗菌株在牛肉膏蛋白胨培養基上劃線，28 ℃恒溫培養1～2 d，觀察菌落顏色和形態，利用透射電鏡觀察菌體形態，同時參考《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）的方法，對拮抗菌株進行革蘭氏染色、生長溫度等生理生化試驗。使用細菌DNA 提取試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA。根據目標基因設計引物gyrB-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和gyrB-R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）（Sharga &Lyon，1998）。PCR 擴增體系（50 μL）為：DNA 模板4 μL，上、下游引物各2 μL，mix 25 μL，ddH2O 17 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，35 個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，16S rDNA測序工作由甘肅科美意生物科技有限公司完成。將所測菌株的16S rDNA 序列上傳Ezbiocloud 網站進行比對，構建系統發育樹，分析與模式菌的親緣關系。

1.2.2 拮抗菌株的抑菌譜測定 采用平板對峙法測定拮抗菌株對辣椒腐霉菌、辣椒灰葡萄孢菌、辣椒立枯絲核菌、辣椒疫霉菌、茄鏈格孢、尖孢鐮孢菌甜瓜專化型、尖孢鐮孢菌西瓜專化型、尖孢鐮孢菌十字花科專化型等重要蔬菜作物病原菌的抑菌效果。以培養皿中心不接種拮抗菌株的平板為對照，每處理3 次重復，每重復3 皿，28～30 ℃恒溫培養2～3 d，測定抑菌圈直徑，計算抑菌率。

1.2.3 拮抗菌株對黃瓜枯萎病的防效試驗 菌劑制備。將拮抗菌株接種于50 mL 液體LB 培養基中，28 ℃恒溫搖床220 r·min-1振蕩培養2 d，4 ℃冰箱保存備用。施用前用無菌水調節拮抗菌劑濃度為1×108cfu·mL-1。

黃瓜枯萎病菌菌懸液制備。將保存備用的尖孢鐮孢菌進一步活化，待PDA 培養基布滿菌絲后，倒入適量無菌水刮取菌絲，經雙層紗布過濾除去菌絲，濾液用無菌水稀釋為濃度1×106個·mL-1的孢子懸浮液。

2021 年9 月，挑選無病蟲害的飽滿黃瓜種子催芽，待胚根長約1 cm 時充分浸沒在黃瓜枯萎病菌菌懸液中30 min，撈出后播種于直徑8 cm 的花盆中，每盆1 株；育苗基質由山東聊城魯億育苗基質有限公司與山東齊魯大學聯合研發，有機質含量35%～45%，腐殖酸含量15%～25%，pH 值5.5～6.5。播種后穴施5 mL 拮抗菌劑，以不施用拮抗菌劑為對照（CK1），以清水浸泡種子、不施用拮抗菌劑為空白對照（CK2）；每處理150 株，3 次重復。常規育苗管理，播種后30 d 調查黃瓜枯萎病發病情況，并測定幼苗根系活力、葉綠素含量、脯氨酸（Pro）含量、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性等指標。

黃瓜枯萎病發病程度及分級標準參考方中達（1998）的標準：0 級，根、莖、葉生長正常；1 級，1/4 以下根、莖變黃，植株稍有矮化；2 級，1/4～1/2根、莖變黃，下部葉片葉脈褪色；3 級，1/2～3/4根、莖變黃，莖基部縱裂；4 級，3/4 以上根、莖變黃或植株直接枯萎死亡。

發病率=發病株數/調查總株數× 100%

病情指數=∑（病級株數×代表級數）/（調查總株數×最高級值）× 100

防治效果=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數× 100%

采用紅四氮唑（TTC）還原法測定根系活力，采用丙酮提取法測定葉綠素含量，采用考馬斯亮藍G-250 染色法測定可溶性蛋白質含量，采用紫外分光光度法測定POD、SOD 活性和Pro 含量（李小方和張志良，2016）。

1.3 數據處理

利用Microsoft Excel 2010 和SPSS 20.0 軟件對試驗數據進行統計及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離及拮抗菌株的篩選

從22 份土樣中分離得到205 株細菌菌株，通過平板對峙法初篩獲得抑菌帶寬度大于1 mm 的拮抗菌株107 株，占比為52.20%。其中，抑菌帶直徑大于4 mm 的菌株55 株，大于5 mm 的菌株38株。采用抑菌圈法繼續對抑菌帶寬度大于5 mm 的38 株拮抗菌株進行復篩，獲得抑菌圈直徑大于18 mm 的菌株22 株，大于20 mm 的菌株6 株（表1、圖1）。

表1 拮抗菌株對黃瓜枯萎病菌的抑制作用

圖1 拮抗菌株對黃瓜枯萎病菌的平板拮抗作用

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 分子生物學鑒定 將拮抗菌株L1-3、L2-3、L2-4、L3-3、L4-2、W4-2 的16S rDNA序列在Ezbiocloud 網站上進行比對，顯示與模式菌株Burkholderia gladioliNBRC 13700T相似性最高，相似系數分別為99.50%、99.01%、99.80%、99.42%、99.43%、99.29%。下載相關序列構建系統發育樹（圖2），本試驗獲得的6 株拮抗菌株均與Burkholderia gladioliNBRC 13700T聚在同一分支內，可初步鑒定這6 株拮抗菌株均為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli）。

圖2 6 株拮抗菌株的16S rDNA 系統發育樹

2.2.2 形態學觀察及生理生化特性測定 通過分子生物學鑒定，拮抗菌株L1-3、L2-3、L2-4、L3-3、L4-2、W4-2 均為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌，選擇其中拮抗效果較好的菌株L1-3 進行形態學觀察和生理生化特性測定。結果表明，L1-3 的菌落淺黃色，圓形，表面光滑、濕潤、稍凸起，邊緣整齊；菌體短桿狀，兩端鈍圓，單個或成對排列；26～37 ℃條件下均能生長，為革蘭氏陰性好氧菌。

2.3 拮抗菌株L1-3 的抑菌譜測定

由表2、圖3 可知，菌株L1-3 對8 種主要蔬菜作物病原菌都有一定的拮抗作用，抑菌圈直徑均大于21 mm，抑菌率為23.74%～38.23%；其中，菌株L1-3 對辣椒疫霉菌和辣椒灰葡萄孢菌的拮抗作用較強，抑菌圈直徑分別達35.33 mm 和31.02 mm，抑菌率分別為38.23%和34.08%。表明菌株L1-3 具有廣譜的拮抗作用，可將其應用于多種植物病害的生物防治。

表2 拮抗菌株L1-3 對8 種主要蔬菜作物病原菌的抑制作用

圖3 拮抗菌株L1-3 對8 種主要蔬菜作物病原菌的平板拮抗作用

2.4 拮抗菌株L1-3 對黃瓜枯萎病的防治效果

從圖4 可以看出，接種黃瓜枯萎病菌后施用L1-3 菌劑的黃瓜幼苗葉片肥大，葉色變深，根系較對照（CK1）增多，與空白對照（CK2）接近。由表3、4 可知，施用L1-3 菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果達64.71%，黃瓜幼苗的根系活力、葉綠素含量、POD 和SOD 活性均顯著高于對照（CK1），且根系活力、可溶性蛋白質含量、POD 和SOD 活性、Pro 含量均與空白對照（CK2）差異不顯著。

圖4 拮抗菌株L1-3 對黃瓜枯萎病的防治效果

表3 拮抗菌株L1-3 對黃瓜枯萎病的防治效果

表4 拮抗菌株L1-3 對黃瓜幼苗的促生效果

3 討論與結論

伯克霍爾德氏菌是近年來在植物根際土壤中發現的一類有益微生物（Paungfoo et al.，2016；Mullins et al.，2019），能夠在至少30 種植物的根系中大量定殖，具有多種促生功能（Kim et al.，2012；宮安東 等，2019）。伯克霍爾德氏菌在根際環境中能夠產生多種抗菌次生代謝產物，可誘導植物獲得系統抗病性，抑制病原菌的生長，促進植物生 長（Wang et al.，2011；Depoorter et al.，2016；許萌杏 等，2021）。此外，伯克霍爾德氏菌還具有降解多種有害物質的特性（Simonetti et al.，2018）。

近年來從根際土壤中分離出的一批伯克霍爾德氏菌屬細菌對植物病原菌具有廣譜的拮抗作用。唐瀅等（2020）研究表明，伯克霍爾德氏菌Z1 對香梨腐爛病原菌迂回殼囊孢菌、西瓜腐皮鐮刀菌、辣椒炭疽病菌、油菜核盤菌及水稻立枯絲核菌有較強的拮抗作用。許萌杏等（2021）研究表明，洋蔥伯克霍爾德氏菌JX-1 對尖孢鐮孢菌苦瓜專化型、簇生長蠕孢菌、高粱莖點霉和立枯絲核菌等病原真菌具有不同程度的抑制作用。孫正祥等（2021）、吳麗娟等（2022）研究表明，伯克霍爾德氏菌YZU-S230 和JP2-270 對水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、馬鈴薯晚疫病菌、草莓灰霉病菌、番茄斑枯病菌、小麥赤霉病菌和多種作物枯萎病菌有廣譜的拮抗作用。本試驗從黃瓜連作土壤中分離出的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌L1-3 對尖孢鐮孢菌甜瓜專化型、尖孢鐮孢菌西瓜專化型、尖孢鐮孢菌十字花科專化型、辣椒腐霉菌、辣椒灰葡萄孢菌、辣椒立枯絲核菌、辣椒疫霉菌、茄鏈格孢均具有較強的拮抗作用，表明菌株L1-3 具有廣譜的拮抗作用，可將其應用于這些蔬菜病害的生物防治。

前人研究表明，伯克霍爾德氏菌可通過生物固氮作用促進甘蔗生長（Paungfoo et al.，2014）。接種雙向伯克霍爾德氏菌或卡瑞苯西思伯克霍爾德氏菌，可以促進籽粒莧的生長，使籽粒莧吸收氮素的能力提高，地上部和根部的氮含量增加（Parra-Cota et al.，2014）。伯克霍爾德氏菌在營養不良的氧化土中，能夠顯著促進菜豆生長（de Oliveira-Longatti et al.，2015）。熱帶伯克霍爾德氏菌MTo-293 能夠在番茄根部定殖且蔓延到植物各個器官，促進番茄生長（Bernabeu et al.，2015）。接種伯克霍爾德氏菌，可以提高水稻對磷素的吸收，促進水稻生長（Stephen et al.，2015；Khan et al.，2017）。吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007 能夠產生嗜鐵素，進而促進黃瓜幼苗生長（閔莉靜 等，2019）。在根部及葉片中定殖花園伯克霍爾德氏菌，可以提高甘蔗幼苗的單株鮮質量和干質量、株高、葉綠素含量；在根部接種伯克霍爾德氏菌MYSP113，甘蔗根部的過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性顯著提高（Malviya et al.，2019，2020）。本試驗結果表明，與對照（CK1）相比，唐菖蒲伯克霍爾德氏菌L1-3 可以顯著提高黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力、過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。

施俊鳳等（2018）研究表明，采前噴施洋蔥伯克霍爾德氏菌菌懸液，可抑制草莓果實表面的病原菌，降低果實腐爛率。Sandania 等（2019）研究了伯克霍爾德氏菌對辣椒炭疽病的生防作用，結果表明伯克霍爾德氏菌對辣椒炭疽病菌的芽孢萌發抑制率達100%，菌絲腫脹增厚、畸形；辣椒種子接種炭疽病菌后進行伯克霍爾德氏菌劑處理，幼苗存活率顯著高于對照。本試驗中，唐菖蒲伯克霍爾德氏菌L1-3 對黃瓜枯萎病的防治效果達64.71%。

綜上所述，本試驗首次篩選獲得的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli）L1-3 除對黃瓜枯萎病菌有較強的拮抗作用外，還對多種蔬菜病原菌有較強的拮抗作用。推測菌株L1-3 可產生多種抑菌物質，或產生的抑菌物質具有較強的抑菌作用，關于菌株L1-3 及其抑菌物質的功能需進一步研究。盆栽試驗結果表明，菌株L1-3 對黃瓜枯萎病的防效達64.71%，并且黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力、過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性顯著高于對照（CK1），表明菌株L1-3 在植物病害生物防治中具有一定的開發潛力，下一步將對菌株L1-3 的抑菌機理、發酵工藝和生防產品的研發進行深入研究。